A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

青龙偃月刀

A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

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摘要：
越来越多实验利用抗体作为辅助蛋白制备衍射晶体。本文给出一个用于制备结晶伴侣的纳米抗体的一般操作流程。
筛选到的纳米抗体可以用于柔性（膜）蛋白质及其复合物的不同构象状态的结构研究。
我们充分利用了对天然抗原的天然体液免疫反应，用天然蛋白质免疫和通过噬菌体展示技术筛选能和功能蛋白构象表位结合的体内成熟纳米抗体。
与其他制备重组结晶伴侣蛋白的技术相比，我们的技术更具有竞争优势。
文中举出三个代表性的例子说明了实验操作是可靠的，能够在6到12个月的时间内，通过纳米体辅助X射线晶体学来解决最具挑战性的蛋白质的结构。

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高质量衍射晶体的制备是大分子X射线晶体学的主要瓶颈。
纳米抗体可以作为结晶复杂生物系统（如膜蛋白、瞬时多蛋白组合、瞬时构象状态、本质无序蛋白）的精细伴侣，或可用作蛋白质错误折叠和纤维形成的结构探针。
纳米抗体（Nbs）具有完全抗原结合能力。能在微生物中大量培养，和Fabs或scfv等传统抗体相比，具有优越的稳定性。
纳米抗体呈现紧凑的长条形，暴露出一个凸的抗体决定簇，可以接触到蛋白表面上常规抗体无法企及的的空洞或裂缝，这些隐匿的表位很容易被纳米体的长CDR3区识别。

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本方法的优势：
本文的实验操作流程用于制备，筛选和纯化体内重组成熟纳米抗体，用于结构生物学研究，耗时3-4个月。
单域抗体结合抗原可以稳定抗原的结构， 并且单域抗体本身分子量小， 对抗原的影响小，天然存在的纳米抗体不会对抗原产生空间构象上的影响，所以单域抗体被用于稳定一些结构不稳定的蛋白， 辅助解析蛋白的结构。
纳米抗体基因组序列来自一个外显子，纳米抗体库包含了所有天然存在的抗原结合的VHH抗体序列，而传统的抗体库是个组成型的库，即人为地将轻链和重链组装在一起。
如果改变抗原结构，不成熟的B细胞分泌相应的纳米抗体会消耗更多的能量，细胞不稳定不利于增殖，很难分化成为成熟的B细胞。

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纳米抗体的局限性：
20年的实验经验让我们确信正确折叠的蛋白都能有空间构象的纳米抗体所识别。
高质量的抗原蛋白是筛选到相应抗体的关键。
纳米抗体和折叠蛋白的空间表位具有高亲和性的结合能力。
但是，对于线性表位，传统抗体比纳米抗体更具优势，传统抗体和线性表位的结合能力更强。

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纳米抗体的应用：
纳米抗体除了作为结晶蛋白的分子伴侣外。在结构生物学的其他应用上也有一定的参考价值。
例如，在电子显微镜（EM）中，域特异性纳米抗体被用作在粒子投影中跟踪这些域的标记。许多纳米抗体在功能上可以在真核细胞中以体内的形式表达，这些单域抗体也可以用作生物传感器，以跟踪活细胞内目标的构象特性。
发现新的治疗靶点蛋白的发现可能最终会限制新的治疗靶点。

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实验设计：制备，分离和鉴定纳米抗体，用于结晶蛋白的伴侣分子

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实验设计--概述

作为结晶伴侣的纳米抗体其制备本质上还是依赖于抗原的性质和结构研究的目的。
纳米抗体的制备主要受几个步骤控制，包括免疫原的制备，筛选策略，不同抗原功能和理化性质的区别。

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实验设计--蛋白产生，抗原质量控制提供正确折叠的蛋白质对于制备构象纳米抗体至关重要。用折叠特征不好的蛋白免疫骆驼不太合适。
标准流程是：需要1mg的蛋白，其中700ug用于免疫骆驼，剩余蛋白用于纳米抗体的筛选，鉴定和表征工作。
理想的蛋白需要稳定性好，可以分装，低温快速冻存增加稳定性。
在蛋白作为免疫原免疫骆驼时，应提前确认其蛋白质质量，定量评估抗原功能的生化或细胞分析[例如，酶/信号活性、与（放射性）配体的相互作用或针对不连续表位的认证传统抗体的结合]，用于评价蛋白质是否正确折叠。
如果蛋白质无法进行功能测试，建议进行严格的生物物理表征，以确认其折叠状态。
除非证明对蛋白质的功能没有任何影响，否则反对多次冻融循环，以尽量减少蛋白质变性。
如果样品不能冻结，考虑在免疫和鉴定实验中使用新鲜准备的蛋白质。

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实验设计--引物设计
从淋巴细胞cDNA中扩增纳米抗体的基因，比较好的方法有两步巢氏PCR方法
以B细胞cDNA为模板，CALL001和CALL002引物用于第一轮PCR，其中引物CALL002识别骆驼常规抗体/重链抗体的CH2区，CALL001引物识别骆驼抗体III家族V基因（骆驼体内最为常见的抗体家族）的信号肽区。得到两种大小的PCR片段，传统VHs 对应的条带是900–1000 bp。VHHs 对应的条带是750 bp，将750 bp处条带利用切胶回收试剂盒回收并定量用于第二轮PCR 的模板。
引物VHH-Back和VHH-For用于第二轮PCR扩增。