A Two-Step Approach for the Design and Generation of Nanobodies

青龙偃月刀

A Two-Step Approach for the Design and Generation of Nanobodies

青龙偃月刀

Orthoclone OKT3是1985年FDA批准的首款单抗药物，开始了治疗癌症，自身免疫性疾病，病毒性疾病的新纪元。
用于诊断或治疗的抗体必须符合严格的标准，以确保他们的功能表现和安全使用。
包括低免疫原性，高的组织渗透性，稳定性好，最好产量高，成本低。
常规抗体约~150 kDa，组织渗透性略差，抗体分子形成二硫键，糖基化等限制了在真核细胞中的表达。

青龙偃月刀

由于传统抗体存在一定的局限性，因此一直在寻求新型的抗体分子。比如一些人工亲和力蛋白，类抗体，单抗体等
单域抗体作为一种新型抗体，15kda大小，具有热稳定性，和可溶性，折叠方式独一无二，在宿主菌中产量很高。
和传统抗体比较具有更好的亲和力，组织渗透性好，可以应用于影像探针，药物靶向治疗，科研试剂如CHIP，亲和色谱等。

青龙偃月刀

纳米抗体通常从免疫库筛选而得，成功得到一些如蛋白配体，激素，小分子药物，毒素，化学试剂的纳米抗体。
然而，免疫库的构建是一个费事的过程，并且饲养大型动物花销很大。
因为免疫库存在客观原因的困难，目前合成库或者天然库是个不错的选择。
但是因为合成库没有预先富集靶标蛋白的抗体，因此要求抗体库库容足够大，筛选手段足够精巧高效。
合成库理论上讲能用来筛选到各种靶标蛋白的抗体，甚至是构象特异的纳米抗体和胞内抗体。

青龙偃月刀

本文采用一个新的方法，将已you有的的非骆驼来源的抗体CDR区移植到纳米抗体的抗体骨架中，然后进一步应用合成噬菌体库进行亲和力成熟。
CDRs区移植是一种能将一种抗体CDR区转移到其他抗体框架，保留了原抗体的结合特异性，同时又赋予新的特性，比如增加稳定性，人源化等的有效技术。
迄今为止，已经获得多种针对多种抗原的抗体用于药用的研究中。

青龙偃月刀

纳米抗体已经有合适的通用骨架载体用于抗体的人源化，如cAbBCII10。CDRs移植策略适用于选用同一类动物来源的抗体用于移植到受体框架的CDRs区。
传统的抗体分为重链轻链两部分，两个链的可变区共同形成抗原结合位点，识别抗原表位。
纳米抗体只有重链，因此将传统抗体的CDR区移植到纳米抗体骨架中需要考虑更多的因素。
框架区对于CDR的形成，方向以及抗原结合能力都起作用。

青龙偃月刀

本文中将非骆驼类来源的抗体中的CDR移植到通用VHH框架生成移植纳米抗体。
但是，采用这种CDR移植方法，仅获得了亲和力较弱的抗蛋白/半抗原结合的纳米抗体。
因此在第二步中，生成了一个VHH合成噬菌体文库，再进行筛选，能获得亲和力提高的具有纳摩尔亲和力的结合物。

青龙偃月刀

通过计算机技术对抗体分子的立体结构进行模拟分析，并鉴定出一些与抗原结合位点关系密切的鼠单抗FR上的氨基酸残基。
第二代CDR移植人源化抗体的构建策略，主要有：
① 模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR。
② 表面重塑，对鼠CDR和FR表面残基进行修饰或重塑，使其类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的型式。
③ 补偿变换，对起关键作用的残基进行改变。
④ 定位保留，以人FR保守序列为模板，但是保留了鼠源单抗可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR区和FR区中的一些关键残基。

青龙偃月刀

所用实验材料原核表达系统SHuffle T7 Express，用于表达抗原蛋白，VHH纳米抗体。
本文中选用两个抗体用于CDR移植，一个针对荧光素的单链抗体2a9n，一个抗A型肉毒毒素轻链C端蛋白的单链抗体FJ643069。

青龙偃月刀

pHJW202质粒 PT7‐Flu‐VHH‐graft‐His6

将能和荧光素结合的单链抗体scFv‐E2其CDR区（红色区域）移植到纳米抗体通用骨架3k1k。

重组基因序列插入到 pRSET‐mod载体中。

Atggcgcaggtgcagctggtggaaagcggcggcgcgctggtgcagccgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggctttacctttggcagctttagcatgagctggtatcgccaggcgaccggcaaagaacgcgaatgggtggcgggcctgagcgcgcgcagcagcctgacccattatgcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgcgcaacaccgtgtatctgcagatgaacagcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgccgcagctatgatagcagcggctatgcgggccatttttatagctatatggatgtgtggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagccatcatcaccatcatcattaa

MAQVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFTFGSFSMSWYRQATGKEREWVAGLSARSSLTHYADSVKGRFTISRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCARRSYDSSGYAGHFYSYMDVWGQGTQVTVSSHHHHHH