Neutralization of SARS-CoV-2 by highly potent, hyperthermostable, and muta

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Neutralization of SARS-CoV-2 by highly potent, hyperthermostable, and mutation-tolerant nanobodies

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新冠单抗是治疗新冠的一种治疗方案。然而，它们在哺乳动物细胞中的生产无法满足全球需求。单域VHH抗体（也称为纳米体）提供了一种适合微生物的替代方法生产。
使用羊驼的SARS-CoV-2棘突蛋白RBD区免疫文库，我们分离出45种感染阻断VHH抗体。
这些抗体能耐受高温95℃。效果最好的中和抗体能在17-50pM的低浓度也能中和病毒SARS-CoV-2。

The most effective VHH antibody neutralizes
at 17-50 pM concentration (0.2-0.7 μg per liter), binds the open and closed states of the Spike, and
shows a tight RBD interaction in the X-ray and cryo-EM structures. The best VHH trimers
neutralize even at 40 ng per liter. We constructed nanobody tandems and identified nanobody
monomers that tolerate the K417N/T, E484K, N501Y, and L452R immune-escape mutations
found in the Alpha, Beta, Gamma, Epsilon, Iota, and Delta/Kappa lineages. We also demonstrate
neutralization of the Beta strain at low picomolar VHH concentrations. We further discovered
VHH antibodies that enforce native folding of the RBD in the E. coli cytosol, where its folding
normally fails.

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免疫小羊驼，建库，PDT筛选
3只雌性小羊驼，皮下接种，免疫5次，间隔一周免疫
两种抗原，均来自义翘神州，
一种是末端为HIS标签的新冠全S1蛋白，每次免疫33ug（为什么这么少的量？）；
一种是刺突蛋白RBD，末端和IgG1的Fc段融合，每次免疫100ug。
PDT筛选，选用生物素化的RBD/S1作为诱饵蛋白，起始筛选浓度200pM。
筛选缓冲液为50 mM Tris/HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1% (w/v) BSA。

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S1抗原，包含两个主要球状结构域：一个大的N端凝集素样结构域（残基27-290），以及受体结合域（RBD，残基~334-527）。
RBD区域和受体ACE2结合，和病毒的感染性相关。免疫小羊驼后，在末次免疫后第四天取血，分离淋巴细胞，建库，库容量10^9（我觉得不太可能）。
筛选抗-RBD和抗-S1ΔRBD，即筛选时加入过量的RBD，得到抗S1蛋白除了RBD区其他抗原表位的抗体。
对筛选得到的672个抗体进行测序，分类。
其中将有代表性的60个纳米抗体序列进行表达，含两个二硫键的纳米抗体在细菌周质中能得以表达，一个二硫键得纳米抗体在细菌胞质内表达。

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得到的纳米抗体进行荧光素标记，检测刺突蛋白转染的Hela细胞，结果90%以上阳性，能检测到荧光蛋白。中和实验中，因为安全起见，需要对样品进行4%多聚甲醛的固定，抗体的结合活性可能会受到影响。

鉴定出7个呈现阳性信号的抗-RBD纳米抗体和几株抗-S1ΔRBD纳米抗体。

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The Re5, 6, 7, 9, 10, and 11 VHH series were selected against the RBD. The Re8 series was
selected against S1 by pre-incubating phages with a 100-fold molar excess of unlabeled RBD. The
Re5、Re6 VHH系列进行两轮筛选，Re7 系列进行三轮筛选，Re8-Re11系列进行四轮筛选。
在对Re9-Re11系列进行筛选时，筛选抗原的浓度低至30pM。
series, the bait concentration
was lowered to 30 pM. Recovered clones were identified by sequencing, and representatives of all
classes were expressed as described below. In off-rate selections, 1 M unlabeled Re5D06 was
added 20 minutes after mixing phages with bait, followed by retrieving phages after various
timepoints and evaluating the effects by sequencing individual clones.

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只有一个二硫键的VHH抗体用SHuffle Express (New England Biolabs)表达系统，在胞质里进行表达，末端带HIS14-SUMO标签。
细菌在300 ml的Terrific Broth (TB)培养基中进行扩增培养，21℃，0.08M IPTG进行诱导表达，诱导后5小时，加入5 mM EDTA 。
收取的菌落用50 mM Tris/HCl pH 7.5, 20 mM咪唑, 300 mM NaCl (裂解缓冲液) ，液氮中冻存，融化后超声，超高速离心去掉包涵体表达产物。
可溶性表达产物用镍柱纯化，100 nM S.cerevisiae Ulp1p室温下对VHH进行切割，去掉HIS14-SUMO标签，纯化后的VHH蛋白低温保存。

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含有两个二硫键的VHH蛋白进行周质表达(Re5E03, Re5E11, Re5G05, Re6E11, Re6F06,Re6G03, Re6H06, Re6H10, Re9F11)
采用E. coli NEBExpress表达系统 (NEB)表达系统进行表达，N端有pelB信号肽序列，C末端有 His10标签，利用渗透压裂解细菌，释放蛋白。
周质提取物采用两步离心法进行收集，第一次离心用4000 g离心20min；第二次离心用38,000 rpm离心1小时。纳米抗体纯化时洗脱液用50 mM Tris/HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 500 mM咪唑。
置换液为50 mM Tris/HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM蔗糖。
置换后-80℃保存。

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酵母中表达VHH纳米抗体 (毕赤酵母)
纳米抗体用酵母菌进行表达，甲醇进行诱导，30℃表达48小时。
Re6H06-His8用镍柱和分子筛进行纯化，-80℃保存。
用于电镜分析和结晶的纳米抗体Re5D06也是经由酵母表达，只是未带标签，通过protein A柱进行纯化。
用于结晶的纳米抗体Re5D06，浓度浓缩调整到33.3 mg/ml (2.32 mM)。

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纳米抗体的标记
通过N端或者C端的半胱氨酸对纳米抗体单体或者三体进行荧光素的标记，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 568，Atto 565标记后的抗体用于荧光免疫。
PEG11-生物素标记的纳米抗体用于BLI实验。