鼠疫菌 F1 抗原双抗体夹心 ELISA 诊断试剂盒的研制

青花瓷

鼠疫菌 F1 抗原双抗体夹心 ELISA诊断试剂盒的研制

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摘要： 研制鼠疫菌 F1 抗原双抗体夹ELISA诊断试剂盒
鼠疫菌 F1 抗原免疫家兔制备抗血清，纯化后作为包被抗体；
制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水，并进行纯化，用 HRP 标记单抗，作为酶标抗体；
连续制备 3 批诊断试剂盒，并建立内部质控品。
对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证。
制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为 5. 2%，板间变异系数为8. 23%；试剂盒的线性范围为 3. 91 ～ 62. 5 ng ／ ml，最低检测限为 3. 0 ng ／ ml；试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性，而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应；试剂盒检测高、中、低 3 种浓度 F1 抗原含量的变异系数为 4. 54% ～8. 4%，回收率在 104% ～ 108%之间；试剂盒稳定性良好，有效期至少为 1 年。

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清洁级家兔，雌性，体重约1 kg菌株 假结核耶尔森菌由甘肃省疾病预防控制中心提供
鼠疫菌 F1 抗原单克隆抗体鼠疫菌 F1 抗原
F1 抗原实验室参考品（冻干制剂，1μg／ml）

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兔免疫及血清抗体效价的测定

用鼠疫菌 F1 抗原背部多点皮下注射免疫家兔，免疫剂量为150 μg／ 只，间隔 2 周，先后免疫5次。
经耳缘静脉采血，采用免疫双扩散法测定抗体效价
兔免疫血清经纯化后，间接 ELISA 法测定抗体效价，合并效价 ≥1 ∶ 256 的有效管，用相对分子质量为 30 000 的超滤浓缩离心管浓缩，收集浓缩样品，加 30%甘油，-20 ℃保存备用。

免疫双扩散结果显示，兔免疫血清抗体效价为 1 ∶ 64，
免疫血清经 Sephacryl S-300 层析纯化，第 1 峰为 IgM，第 2 峰为目的蛋白（IgG），第 3 峰为杂蛋白峰，含少量的IgG。
间接 ELISA 结果显示，纯化并浓缩后的 IgG 抗体效价为 1 ∶ 10^7

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纯化的鼠疫菌F1抗原单克隆抗体的检定
腹水经 Sephacryl S-300 凝胶柱层析纯化，第1峰为IgM，第2峰为未分离开的IgM与IgG混合物，第3峰为目的蛋白峰（IgG）。
收获第 3 峰，蛋白浓度为4. 62mg／ml；

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鼠疫耶尔森菌免疫保护性抗原主要是荚膜蛋 白抗原分子 (fractionF1)和表面抗原(v)分子 。F1抗原是一种荚膜蛋白，由 100kb的 pFra质粒编码，是鼠疫菌的特异性抗原之一。F1抗原位于菌体表面，有抗吞噬作用，可诱导机体产生抗体，与抗 鼠疫感染有密切关系，是制备新型疫苗不可缺 少的成分。