鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELISA检测方法的建立

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鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELISA检测方法的建立

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摘要：
建立ELISA双抗体夹心法 ，测定重组毒力因子 rV抗原含量 。杂交瘤技术制备鼠疫菌rV抗原的鼠单克隆抗体，对抗原表位和单抗特异性进行分析及鉴定 ，建立 ELISA双抗体夹心法，并验证方法的专属性 、准确性 、精密度和线性范围。
成功组建了鼠疫菌 rV抗原诊断试剂 ，灵敏度最低检测值为10ng/mL。
该方法可用于免疫学检测鼠疫组分疫苗原液rV抗原含量及制备过程中抗原活性 ，可以作为鼠疫组分疫苗制备中一种重要的质量控制手段。

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鼠疫耶尔森菌荚膜物质 F1抗原和毒力因子V抗原 ，能有效诱导机体产生血清抗体和黏膜抗体应答 ，是抵抗鼠疫菌感染的重要保护性抗原 。研制了 F1+rV组分疫苗 ，它将是免疫效力持续时间长 、安全性更好的疫苗。
为了能使新型组分疫苗的质量得到有效控制 ，需要建立一套完整的检测方法。

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杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性 表型鉴定除了9B9外，均很稳定。
所有抗体都是IgG2a型

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单抗活性和特异性鉴定
37kDa的rV抗原经蛋白电泳后，加入4种单抗作为待检抗体，均能检测到特异性条带。

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单克隆抗体的抗原结合表位分析结果：
间接ELISA检测各株单抗间的抑制率，2E2和9B9相互之间的抑制率均大于80%，两者识别同一表位或者几乎相同的抗原表位。
3C10对2F2，9B9，1C10的抑制率小于50%，认为他们识别不同的表位。
初步判断三株抗体识别不同的抗原表位，这些抗原表位相距较远，不存在表位间的位阻干扰。

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双抗体夹心 ELISA检测方法的建立
1)抗体包被缓冲液的确定：
pH=7离子强度为 0.1M的磷酸包被缓冲液 ；
pH=9.6离子强度为 0.1M的碳酸包被缓冲液
两种缓冲液用于包被各株单抗，再加同一浓度的 rV抗原 ，同时设阴性对照及空白对照，加入辣根过氧化物酶标记的抗不同表位的单抗，显色后判定结果，阳性值最高，阴性值最低的包被缓冲液为最适包被缓冲液。

0.1M的pH=9.6的碳酸盐缓冲液确定为最佳包被条件。

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2)包被抗体与标记抗体的选择
将抗不同表位的 McAb分别作为酶标记抗体和捕获抗体，采用棋盘滴定法建立双抗体夹心法，筛选灵敏度高 、特异性好的抗体作为包被抗体与标记抗体。

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捕获和测定抗体的最佳配对：
对各种抗体的组合配对试验。将每一株单抗分别与其他3株酶标记抗体进行相互配对 ，有 4组单抗组合可以较好的检测 rV抗原。
最终选择 2E2为包被单抗 ，HRP-3C10为测定单抗
组成最佳的单抗组合用于构建双抗体 ELISA夹心法。

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试剂的特异性：试剂只与鼠疫菌 rV抗原发生阳性反应 ，与鼠疫菌F1抗原及大肠杆菌不发生交叉反应。