人重组IL-17／His蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性

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人重组IL-17／His蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性

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摘要
目的：研究人IL-17的体外生物学活性。
方法：RT-PCR的方法克隆得到了hlL17基因序列,装入PQE3.0原核表达载体构建重组表达载体hIL-17／PQE3.0。导入宿主菌M15，经IPTG诱导产生IL-17／His融合蛋白，并经Western blot实验确认。
(M15菌株细胞含包含反式lac抑制子的pREP4质粒，这个质粒高水平表达lac抑制子，在IPTG诱导前反式抑制蛋白表达。保证高度调控的表达。)
结果：原核表达的hIL-17／His重组蛋白经变性、复性后，利用HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明，该融合蛋白具有刺激人宫颈癌细胞株HeLa分泌IL-6和GM—CSF的作用。
结论：制备了具有生物学活性的IL．17／His重组蛋白，为进一步研究该分子在自身免疫疾病
等方面的作用奠定了基础。

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背景资料：
人IL-17是目前国际上高度重视的细胞因子。
1993年Rouvier首次从激活的T细胞杂交瘤中克隆出啮齿类CTLA8的cDNA序列，与人的IL-17的DNA序列有63％的同源性。
人IL-17，染色体定位于2q31，155个氨基酸，N端为19～23个残基组成的信号多肽，分子量32KDa的同型二聚体。
在体内主要由CD4+T淋巴细胞产生。
人IL-17能诱导基质细胞产生多种炎性细胞因子，如IL-6、IL-8、G-CSF等。与IL．17相关的ILl7T细胞是新近证实的一个T细胞亚群，该群细胞以其特征性地分泌IL-17分子而不同于Thl和Th2这2类经典的T细胞亚群。
IL一17参与了体内多种疾病的发生和发展，尤其在支气管哮喘、狼疮性肾炎、器官移植和肿瘤中起了重要的作用。

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实验中用到的主要材料
PQE3.0载体和M15表达菌种（Qiagen公司）
PHA、IPTG和Q-Separose分离介质（Sigma公司）；
人IL-6和人GM-CSF ELISA试剂盒（Invitrogen公司）
商品化IL-17蛋白(GenScript公司 Cat No：Z02023 备注：现在已经没有Z02023这个货号，更换为了Z03228)商品化的IL-17蛋白为CHO来源的真核表达蛋白，大小为14-22KDA，序列为GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVAHHHHHH
参考的GENBANK 序列号为：Q16552
抗人IL—17单克隆抗体(Clone：41802；美国&D公司)
宫颈癌细胞株(HeLa)

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目的基因的获得及载体的构建
从正常成人外周血中经密度梯度离心法分离单个核细胞。
铺板培养2 h后吸出悬浮细胞，用绵羊红细胞纯化获得较纯的T细胞，PHA活化48 h后收集细胞，抽取mRNA并反转录成cDNA，扩增出不带有真核信号肽的hIL-17基因，长约500 bp，插入PQE3．0载体构建原核表达载体，转化M15细菌。

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培养及诱导表达
hIL-17／His／M15单菌落接种于LB培养液中(含适当浓度的氨苄青霉素和卡那霉素)。
37℃摇菌过夜至饱和。
次日以1：40接种新鲜的LB培养液中，继续在37℃摇菌，至OD值达到约0.6～0.8时加入0.5mM的IPTG继续培养。
分别于0、0.5、1、2、3、4、6、8 h收集细菌，4℃条件下5 000 r／min离心5 min。用预冷的PBS洗菌体1遍，离心收集细菌，超声破碎。
SDS-PAGE分析显示诱导的样品中呈现时，15 000左右较高水平的蛋白条带，37℃诱导4 h即可获得最大量蛋白，以包涵体形式存在，上清中无可溶性融合蛋白的表达。

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包涵体的纯化
(1) 超声破碎包涵体：
1. 4℃，5000 r／min离心5 min。用预冷的PBS洗菌体1遍，离心收集细菌，一70℃冷冻30 分钟，室温复融，反复3次。
2. 将100 mL培养所得的菌体重悬于5 mL双蒸水中。冰浴超声破碎菌体，每次30S，间歇30s，超声30次。
3. 超声破碎后的菌体悬液，以12000 r／min，离心15min，弃上清。
(2)包涵体洗涤：为什么要洗涤？
在收集的沉淀中，除了包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白，肽聚糖，脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后续纯化带来困难。
洗涤原则：熔解杂质，不溶解包涵体中表达产物
1. 将破碎后离心所得的包涵体在不同浓度的尿素(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 moL／L)中，室温作用30min。
2. 5000 r／min离心5 min后，上清进行SDS-PAGE电泳分析包涵体所能承受的最佳尿素浓度。包涵体洗涤液：50mmol/L Tris-HCl，pH=8，5mmol／L EDTA，2g/L，Triton X-100，200ml/L甘油，0.5-8mol/L尿素
经过反复洗涤后，IL-17/his重组蛋白包涵体百分含量由30%左右上升到50-60%。
(3) 包涵体的变性：
1. 将包涵体按湿质量1 g／100 mL比例加入不同pH值的变性液(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)中，别在不同的温度(4℃，室温，37℃)作用2—5 h。
2. 12000 r／min离心，10 min，上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。
变性液：50 mmol／L Tris·HCl，8 moL/L尿素，50 mmol/L DTT，0.1 mmol／L PMSF
(4) 包涵体的复性：
1. 变性后的包涵体高速离心12000r/min，10 min。
2. 所得的上清以稀释复性法中的逐滴稀释法进行复性，所有的复性方案均在空气氧化条件下进行。

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His亲和层析柱纯化复性后的蛋白
1. 复性后的蛋白以1：50的比例，在PBS(pH=7.3)中4℃透析过夜，中间换液3次。
2. PEGl0000浓缩后，10 000r／min，10 min，除去不溶物，经0.22um滤膜过滤。
3. HiTrap亲和层析柱预先用PBS平衡，步骤2中处理好的样品上样，流速1.0 mL／min。
4. 再用含10 mmol／L谷胱甘肽(GSH，Sigma产品)的50 mmol／L Tris—HCl缓冲液(pH9．0)洗脱收集洗脱液，行SDS—PAGE电泳分析复性后蛋白的纯度。
HIS标签的蛋白为什么用GSH洗脱？

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IL一17／His重组蛋白包涵体在经过反复洗涤后，其百分含量得到了提高，从30％左右上升到50％-60％。

Western blot分析表明纯化后的IL-17为15 000左右，和商品化的人IL-17大小一致（C图中第一道为商品化蛋白，2为纯化后蛋白，3为纯化前蛋白。）

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生物学活性测定
将HeLa细胞以5×10^3／孔铺于96孔培养平板中，分别加入不同浓度的IL-17蛋白以及商品化蛋白，培养48 h后，收集培养上清，ELISA检测上清中hIL-6和GM-CSF的含量。
纯化的IL-17能促进HeLa分泌hIL-6和GM-CSF，与标准蛋白比较，纯化后获得的蛋白活性与商品化蛋白相比并无统计学意义。