SARS 病毒快速检测膜研制

青花瓷

SARS 病毒快速检测膜研制

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摘要:
建立一种快速检测严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV) 的方法。
表达SARS 冠状病毒刺突蛋白羧基端片段，作为抗原包被硝酸纤维素膜，捕获感染SARS病人血清中的抗体。
5min 肉眼即可观察到结果。
通过本产品检测已经过ELISA 验证的50 份血清样品证明两种检测结果无显著性差异( P > 0.05) 。
与ELISA相比，该检测方法特异性、灵敏性几乎相当，且简单、快速、成本低廉，适合于初步诊断和流行病学调查。

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背景摘要：
2002年，全球8439 例SARS 病毒感染，平均病死率超过10%。
SARS 病毒检测方法大致可分为三类:
① 基因检测方法( PCR 检测)：适于早期检测且有较高的特异性，但易出现假阳性且灵敏度较差。
② 免疫学方法：有免疫荧光和酶联免疫两种手段，它们具有检测速度快(一般1～2h)，操作简单，成本低，高通量检测等特点。
③ 细胞学方法：最早的实验室检测方法，可以通过感染性细胞培养增殖出大量病毒，并通过电子显微镜直接观察病毒颗粒，耗时长，不适合大量检测。

本文中开发了免疫金渗滤法快速检测技术，又称斑点金免疫渗滤试验，是一种快速免疫学测定方法，是胶体金标记技术与快速免疫斑点技术结合的产
物。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体在固相膜上快速反应，然后用胶体金标记的抗体来进行直接显色。

本文中实验应用SARS 冠状病毒变异株spike 基因S2 区强抗原决定簇片段的重组抗原，采用生物免疫学间接法原理，结合纳米金渗滤和固相标记技术进行检测，除具有酶免疫试剂盒准确、特异的优点外，还具有操作简便、快速定性、采样量小、无需任何仪器、单人份使用、目测显示结果、室温储存、运输方便等特点。

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实验用材料：
SARS 冠状病毒spike 基因S2 区蛋白。
阳性血清22 份、阴性血清8份和正常血清20 份
葡萄球菌蛋白A ，硝酸纤维素膜。

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硝酸纤维素膜的活化及金标SPA 的制备　
用二乙烯矾处理硝酸纤维素膜，再由乙二胺连接氨基，最后再用戊二醛单体、高聚物与手臂上的自由氨基分别反应将NC 膜活化。处理后的膜可直接用于蛋白质的包被。
纳米金按Frens的柠檬酸钠还原法制备。
取1ml 已调至pH=6.0 的纳米金溶液，逐滴加入13μl SPA ，混合振荡30min，加入5 %浓度的BSA 至其最终浓度为1 % ，封闭45min，确保纳米金-SPA 复
合物稳定，15 000g ，4 ℃离心45min ，弃上清，用1ml pH=7.2的PBS复溶沉淀，重复离心1次，沉淀复溶于1ml 含0.2 mg/ mL PEG(MW 20 000) 的pH=7.3 PBS 中，即为纳米金-SPA 复合物，4 ℃保存备用。
电镜下观察：

可见按上述方法制备的纳米金均呈单分散状，颗粒大小基本一致，金颗粒直径分布范围为13.75～20.00nm 。

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SARS冠状病毒spike 基因S2区片段（840bp）插入到pET28 载体中
原核表达，大小约为34.8kD ，可溶性表达。

将制备的纯化抗原包被Elisa板，将SARS 阳性血清倍比稀释为1 :20 、1 :40 、1 :80 、1 :160 、1 :320 和1 :640，在1 :320 时仍能得到阳性结果。