纳米抗体技术及其在疾病诊断和治疗中的应用

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第二种方法：
利用VHH 与VH基因差异性(图1)以及所有的VHH基因具有相同的外显子和同源序列的特性．采用巢式PCR 技术扩增VHH 片段。
先用一对引物将VHH 至CH2 以及VH 至CH2 之间的片段扩增，得到不含有CH1 或含CH1 两种不同长度的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以将不含CH1 的HCAb 重链部分分离出来(约600 bp)，接下来利用一对含限制性内切酶位点的巢式引物，将针对性扩增VHH 片段。
该方法可用于单峰驼、无峰驼、双峰驼以及羊驼IgG3 中VHH 片段的扩增，将PCR 扩增所得VHH 基因转入特定的表达载体中，便得到了包含完整抗原结合区域的VHH库．相较于传统抗体建库，VHH 库的建立过程更加简单，所需的库容量也更小。

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人工合成VHH库的构建
利用简并密码子NNK(随机改变库的寡核氨酸)增加VHH 中CDR3核苷酸多样性，并通过重叠延伸PCR 技术，重组、扩增目的基因，可构建针对特殊抗原的VHH库。

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纳米抗体技术在疾病诊断与治疗中的应用

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在疾病诊断中，纳米抗体技术多采用酶联免疫法(ELISA)进行检测‘
其中使用中较为广泛的是双抗体夹心法
对应纳米抗体的“三明治”结构(即第一种Nb- 抗原-第二种Nb)，此结构包含了两种能和抗原不同表位结合的纳米抗体。
第一种Nb为捕获抗体，第二种Nb为检测抗体。
将捕获Nb固定于载体上(用于捕获待测抗原)的方式有两种方式：
a．磁珠纳米颗粒键合，即将金属氧化物的纳米颗粒和磁性颗粒结合，利用共价键键合结合捕获抗体；
b．生物酰化处理，即融合表达捕获抗体与生物酰素，利用生物酰素与链霉亲和素的结合能力间接结合抗体。

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纳米抗体在肿瘤诊断中的应用
EGFR 家族蛋白常作为抗癌研究的靶标热点．目前，临床上采用以放射性元素或其他方法标记的单克隆抗体作为显像剂的分子显像技术确定病人体内肿瘤分布情况．但单克隆抗体在血液中的保留时间过长，导致检测背景值过高，显像效果不理想．而针对肿瘤的特异性纳米抗体可以更好地渗入癌变组织，识别传统抗体无法靶向的活性位点，是理想的显像剂载体。
近红外波长范围内的光被人体组织吸收的较少，穿透性较好，且其非特异性背景信号较低，故可作为癌症检测的重要显像手段。
Van Driel 等使用NIR 荧光-FLARE显像系统进行小鼠体内口腔鳞状细胞癌的显像研究．耦合了荧光团IRDye800-CW 的纳米抗体可以特异性靶向并绑定OSCC中过量表达的EGFR，能清晰地显示OSCC 及颈部淋巴结的转移情况，在临床上有着十分可观的应用前景。

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赫赛汀(曲妥珠单抗)是治疗乳腺癌的首个分子靶向药物，主要针对HER2阳性的癌症病人，但对HER2 表达较少或表达多样化的病人治疗效果较差，且其价格昂贵，长期使用会使患者产生耐药性，用曲妥珠单抗治疗前需准确测定患者体内HER2 表达情况。
Pruszynski研究表明，放射性碘化试剂SGMIB 标记针对HER2 的Nb(5F7GGC)为显像剂(5F7GGC-125/131I-SGMIB)注入异种移植小鼠，肿瘤吸收2 h达到峰值，且肿瘤与正常组织吸收比值可达到50∶1，能准确反应癌症中HER2 表达情况．此外，由于纳米抗体能更快地被正常组织清除，可与半衰期较短的放射性核素68^Ga、18^F 或211^At结合，用于分子显像或靶向治疗。

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纳米抗体在肿瘤治疗中的应用
化学药物疗法是临床上常用的肿瘤治疗方法之一， 烷化剂、抗代谢药物、抗癌抗生素等化疗药物在体内杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞产生非特异性毒性。
用于治疗结肠癌和直肠癌的第三代铂类抗癌药物奥沙利铂在体内有50%与红细胞结合，从而造成一定的周围神经毒性．相较于“裸药”，纳米抗体与高分子液泡／脂质体耦合的药物载体可以提高药物溶解度、稳定性；
利用纳米抗体靶向传递药物；通过改变高分子液泡／脂质体的双亲结构达到控制药物释放的目的。
Der Meel 等报道了将类胰岛素生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)抑制剂(AG538)封闭在脂质体内，并将其与抗EGFR 的b(EGa1)耦合形成EGa1-AG538-liposomes 结合物。
研究结果显示，该药物载体可达到同时阻遏EGFR 和活化IGF-1R 的双重效果，有效抑制肿瘤细胞扩散，是治疗由EGFR和IGF-1R过度表达引起肿瘤的理想药物。

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caplacizumab是一种首创的（first-in-class）抗血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）纳米抗体，开发用于获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）的治疗，这是一种超罕见、急性、危及生命的凝血障碍，首个专门治疗aTTP的药物。
caplacizumab（ALX-0081）是一种强效选择性双价抗vWF纳米抗体，于2009年在美国和欧盟被授予孤儿药地位。caplacizumab能够阻断超大vWF多聚体（ULvWF）与血小板的相互作用，因此，针对血小板聚集和随后发生的微小血凝块（microclot）的形成和积累具有立竿见影的效果。在aTTP患者中，这种微小血凝块能导致严重的血小板减少症、组织缺血和器官功能障碍。caplacizumab的这种瞬间效应（immediate effect，即瞬间见效）在拆解潜在疾病进程的同时，能够保护aTTP患者出现疾病临床表现。
Ablynx是位于比利时的一家生物制药公司，致力于纳米抗体的开发，这是一种基于单结构域抗体片段的治疗性蛋白，结合了传统抗体药物的优势（目标靶点的高特异性、亲和性与低毒性）和小分子药物的一些特点（纳米级尺度，能进入受体缝隙），可开发用于一系列重大疾病的治疗。目前，Ablynx公司管线中有超过45个纳米抗体项目，涉及炎症性疾病、血液病、免疫肿瘤学及呼吸系统疾病。

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目前VHH 库的筛选方法除了利用酶联免疫法对细胞表达产物进行筛选外。
通过选用线性噬菌体(包括M13、f1、Fd、ft 等株型) 进行噬菌体展示以筛选阳性克隆的方法更为常用。

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纳米抗体作为治疗型抗体时，需要进一步复杂地操作和优化。
而作为研究用抗体时，相对简单，比较常用的可以用于WB，ELISA等，蛋白检测，用于进行辅助研究。