A Two-Step Approach for the Design and Generation of Nanobodies

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pHJW258 PT7‐Streptag‐BoNT/A‐LC

A型肉毒毒素轻链融合到Strep‐tag®标签。
原核表达载体，表达A型肉毒毒素的轻链蛋白。

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pHJW268 PT7‐BoNT/A‐LC‐VHH‐graft‐His6

将能和A型肉毒毒素轻链蛋白的单链抗体scFv其CDR区移植到纳米抗体通用骨架cAbBCII10。

重组基因序列插入到 pRSET‐mod载体中。

进行原核表达。

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两株移植纳米抗体的原核表达

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通过ELISA检测移植抗体和抗原的结合能力

BoNT/A-LC移植抗体和抗原有结合能力，但是比较弱。
抗荧光素移植抗体和荧光素-BSA也有结合能力，但是和对照比较，也不算高。
因此，需要进一步构建合成VHH抗体库，通过噬菌体展示进行亲和力成熟，富集结合能力强的纳米抗体。

之前有文献报道，利用合成抗体库筛选到蛋白的纳米抗体。本文则用半抗原即荧光素进行筛选，试试能否筛选到抗荧光素的纳米抗体

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合成库的构建：实验方案是对已有的移植纳米抗体CDR2/CDR3区进行随机化设计。
参考比对数据库中已知的8个半抗原和9个蛋白结合抗体序列。

可以看到在CDR2和CDR3区存在很强的多样性(如CDR2区的60,64,67和69位置)。
基于这些自然存在的多样性，推测这些位置可能有益于亲和力成熟。

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最终将CDR2或者CDR3区进行处理，将高变位点进行随机化突变。常规法构建噬菌体纳米抗体库，库容量为1.05×10^7。

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对噬菌体库进行两轮筛选。用荧光素标记的BSA作为固定相进行筛选。
用ELISA进行结合活性检测，得到一株D4抗体有结合活性。
序列进行比对，在发生微店改变的15个氨基酸序列里有13处不同。

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对D4抗体进行原核表达，ELISA鉴定和荧光素的结合活性。加入游离的荧光素可以和包被的荧光素-BSA竞争结合抗体。

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用Fortebio对抗体的亲和力进行进一步的鉴定

解离常数KD为20 nM

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纳米抗体免疫库耗时，耗钱，合成库能部分解决这些问题。
天然库也可以用于筛选得到半抗原特异的或者拟似的纳米抗体，但是对库容量的要求较高。
Furthermore and in
contrast to immune libraries, single synthetic libraries can be used for the isolation of antibodies
with different specificities. However, the design of synthetic libraries requires detailed knowledge of
antibody structure and function. Sophisticated strategies have been applied for the construction of
synthetic Fab and scFv libraries [60–64].