Construction and Characterization of a Novel Recombinant Attenuated and Repli...

青花瓷

Construction and Characterization of a Novel Recombinant Attenuated and Replication-Deficient Candidate Human Adenovirus Type 3 Vaccine: ‘‘Adenovirus Vaccine Within an Adenovirus Vector“

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摘要：
构建了基于5型腺病毒商品化载体为基础的3型腺病毒复制缺陷型病毒

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背景资料：
ε-表位主要集中在六邻体蛋白中

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实验材料：
AD293细胞，用于培养复制缺陷型病毒。
HAdV-3 GZ01 病毒株 (DQ099432)，从ARD患儿分离而得，在A549细胞上能培养。

菌株DH5a和BJ5183
质粒pShuttle和pAdEasy，来自商品化的AdEasy Adenoviral Vector System (Stratagene; CA,USA).

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构建含HAdV-3六邻体蛋白的rAd3H重组腺病毒，首先通过同源重组的方法构建了含3型腺病毒载体六邻体，报告基因的5型腺病毒全长克隆pAd3H。
酶切鉴定质粒，和预期一致。

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重组质粒prAd3H用Pac I线性化，转染AD293细胞后。
荧光镜下看到绿色荧光日益增多，产生重组病毒rAd3H。
转染后第10天，将病毒液反复冻融3次，离心弃细胞沉淀，取上清再次感染AD293细胞。
观察到在感染后第8天，荧光信号和CPE明显。

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反转录-PCR鉴定和WB实验鉴定病毒颗粒中HAdV-3六邻体蛋白的转录和表达
在这个实验中，缺乏E1和E3基因的5型腺病毒基因组作为阳性对照。
提取rAd3H病毒培养液中的病毒RNA，用DNA酶消除掉残余的DNA，用RNA 进行反转录，PCR扩增六邻体基因。
图A：直接用RNA进行PCR扩增，得不到预期的条带
图B：用RNA反转录产物cDNA进行PCR扩增，得到预期的条带。
图C：WB检测， rAd3H培养上清中能检测到3型腺病毒的六邻体蛋白的表达。而阴性对照5型腺病毒 rAd5 培养液中检测不到3型腺病毒六邻体蛋白的表达。

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rAd3H感染AD293细胞，在产生90% CPE时，收集，反复冻融培养液，12000g离心10分钟。用于电镜观察。可以观察到腺病毒样病毒颗粒（70-90nm）。

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rAd3H病毒颗粒的生长曲线
通过荧光定量PCR对病毒rAd3H, rAd5以及HAdV-3活病毒的基因组复制进行监测，扩增的PCR片段位于五邻体基因区域。生长曲线很相似。

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rAd3H重组病毒的稳定性研究
rAd3H在AD293细胞中能稳定传代20代。第20代依然能看到CPE和绿色荧光表达。扩增3型腺病毒六邻体基因，结果阳性，测序正确。

而将rAd3H感染A549细胞，监测不到荧光蛋白的表达，说明重组腺病毒能在AD293细胞中复制，包装形成病毒颗粒。
而A549细胞由于缺乏E1基因，重组病毒不能在细胞中复制，无法形成新的病毒颗粒。