Development of potent and effective synthetic SARS-CoV-2 neutralizing nanobodies

青花瓷

Development of potent and effective synthetic SARS-CoV-2 neutralizing nanobodies

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本文献报道了一种能治疗新冠疾病的人源化的中和纳米抗体。该纳米抗体从一个高多样性的合成库中筛选而得。
能和新冠病毒RBD区高度结合，阻止新冠病毒S蛋白和细胞受体hACE2受体结合，起中和病毒作用。

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青花瓷 发表于 2021-10-1 21:24
本文献报道了一种能治疗新冠疾病的人源化的中和纳米抗体。该纳米抗体从一个高多样性的合成库中筛选而得。
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SARS-CoV-2流行带来的危害已经超越了1918–1919的流感大流行。
单抗治疗，如恢复期患者血清，能在预防和治疗病毒感染中发挥作用。
最近报道的一个比较好的临床治疗方法有联合三种抗体的鸡尾酒疗法，对新冠患者，阻止病情恶化有很好的疗效。

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目前研制的中和抗体靶标多为S蛋白，S蛋白高度糖基化，限制了可变区表位的利用，影响治疗效果。
VHH单域抗体和传统抗体相比较，能接触到更多的表位，有利于得到有效的中和抗体。

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质粒构建和蛋白表达
① pSF-CMV-SARS-CoV-2-S
表达SARS-CoV -2 S基因的1-1208位(GenBank:MN908947.3) 的真核表达载体，此外，羧基端含有T4纤维蛋白三聚体，TEV切割区域，Twin-Step标签，8HIS标签。
② pSF-SARS-CoV-2-RBD N端为Kozak序列，信号肽序列 (MDWTWRFLFVVAAATGVQS), SARS-CoV-2 S基因的319– 577位 (GenBank:MN908947.3), 羧基端为TEV 切割位点，10HIS标签
③ pAce2-huFc
能表达ACE2-人Fc 融合蛋白
④ Ace2-rbFc
ACE2和兔Fc段进行融合的蛋白构建的表达S或者RBD蛋白都是通过瞬时转染Expi293F悬浮细胞 (Thermo, A14527)而得。
HIS柱纯化，纯化后的S蛋白置换到20 mM HEPES (pH 8.0), 200 mM NaCl溶液中，Enrich 650 SEC柱子进行浓缩(Biorad, 7,801,650) ，调整浓度。
RBD蛋白用PBS缓冲液置换，和透析浓缩。

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ACE2-huFc, ACE2-rbFc和VHH-huFc蛋白，是通过转染到CHO-S细胞中进行瞬时表达 (Thermo, A29133). 表达蛋白用HighTrap MabSelect柱进行纯化。
置换保存液为10 mM sodium phosphate (pH 7.2), 140 mM NaCl。

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噬菌体合成库的设计和构建
VHH phage library construction and productionSynthetic VHH library was designed as follows. A high diversity library was designed by incorporating the natural prevalence of amino acids at positions in CDR1 and CDR2 based off 670 functional VHH antibodies deposited on sdAb-DB (www.sdab-db.ca).14 Amino acids cysteine and methionine were omitted from all CDR loops and full diversity was used for CDR3. Asparagine was also omitted from CDR1 and CDR2. The library was also designed such that there would be 3 different lengths of CDR3 (9-, 12-, and 15-amino acids). Linear double-stranded DNA fragments incorporating the specifications mentioned above, as well as terminal flanking BglI restriction sites, were