人表皮生长因子受体-2（Her2）的纳米抗体

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Human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2）人表皮生长因子受体-2
2017年2月国家癌症中心公布《2017国家癌症报告》显示，乳腺癌高居当代女性罹患癌症种类的榜首，发病率高出第二位的甲状腺癌一倍，其中大城市女性的发病率更是达到了59.7／10万人。
乳腺癌的高发性使其治疗成为研宄热点。
由于乳腺癌细胞对HER-2过表达，因此被视为乳腺癌预后不良的重要预测因素。
HER-2阳性乳腺癌新辅助治疗相关问题己成为肿瘤学关注的热点问题。

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HER-2，又称c-erb-2，定位于17号染色体12-21.32上，是编码相对分子质量为185KDa左右的跨膜酪氨酸激酶受体。
尽管没有找到HER-2的配体，但是HER-2却能和其他表皮生长因子受体家族成员形成同源或异源二聚体以产生高亲和力的配体复合物.

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目的: 获得靶向人Her2纳米抗体 。
方法: 使用重组人Her2蛋白免疫羊驼, 构建噬菌体表面展示的纳米抗体文库.
结果： 第二轮筛选后得到2个抗体H3和H5，其中H5的亲和力达 0.8106pM 。可识别乳腺癌组织中Her2 抗原的表达。
结论：从Her2 免疫的羊驼体内，筛选获得了1个具有较高抗原结合活性的Her2纳米抗体，可用于乳腺癌的病理诊断。

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菌株和质粒：
大肠杆菌BL21和TG1辅助噬菌体VCSM13
载体 pMES4
Her2 阳性乳腺癌病理切片
健康成年羊驼 2 只
重组人Her2 蛋白
HRP标记山羊抗羊驼IgG二抗
HRP标记小鼠抗M13二抗  
Ni—NTA树脂
免疫方案：
采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼 ，用量为人重组Her2蛋白 400μg/ 次， 共免疫4次 ，免疫间隔为2 周。结束后5d ，颈部采集抗凝全血20ml， 取 1ml进行ELISA 效价分析。 其余用来分离淋巴细胞。第四次免疫后，羊驼体内的抗体滴度能达到1×10^6。

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第一轮和第二轮，以及测序引物序列：

库容量能达到4×10^7

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免疫组化：
① 石蜡切片脱蜡至水，3％ H2O2 窜温孵育 30分钟；柠檬酸盐抗原修复液进行抗原修复 ；② l0％ 山羊血清 37℃封闭30min；
③ 滴加一抗 ，4℃过夜，样品组滴加H5 ， 阳性对照为曲妥珠单抗(赫赛汀 ，trastuzumab，Herceptin) ， 阴性对照为PBS ；
④ 滴加二抗，37℃孵育30 ～60分钟，阳性对照二抗为HRP-标记的山羊抗羊驼IgG（这个不大可能吧？） ，样品组二抗为HRP-标记的小鼠抗M13；
⑤ DAB显色 2 ～10min后用自来水充分冲洗 ； 苏木素复染， 脱水，透明 ， 中性树脂封片，镜下观察。

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筛选到的两株纳米抗体进行原核表达：

有一个不解之处，为什么噬菌体DIII蛋白没有了，只有纳米抗体？转化BL21细菌，理论上讲不能识别琥珀型终止密码子。

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对H5进行BIacore分析：
亲和力为达 0.8106pM

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病理切片免疫组化结果：赫赛汀是人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。
此抗体属IgG1型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185HER2抗体的互补决定区。
人源化的抗HER2抗体是由悬养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO)产生的，用亲合色谱法和离子交换法纯化，包括特殊的病毒灭活的去除程序。

H5能与表达Her2的乳腺癌阳性肿瘤细胞结合， 但是H5的亲和力低于阳性对照。

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WB结果：

WB结果和预期不一致。
这篇文章中的实验操作有点问题