Vibrio fluvialis 河弧菌LPS的纳米抗体

青花瓷

P40-41:
噬菌体克隆分别与脂多糖和细菌进行 Phage-ELISA 鉴定，后者的显色值均高于前者（真没看出来，中国人不骗中国人）。

青花瓷

01034
这篇硕士论文，看结果不太理想，没筛选到合适的用于分型的纳米抗体。
这个后续有篇英文文章，工作又有新的进展。

青花瓷

01035
后续工作中V23结果最好。

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热酚水法提取LPS：
过夜培养河弧菌（LB培养基），7000g离心20min，弃上清，称取菌团湿重；
每克的菌用1.5ml的68℃预热水悬起，加入等体积的90%酚，并于 68 ℃水浴中持续振荡混匀 30 min；
待溶液冷却后，放置于 4 ℃冰箱，并于冰上冰浴约 2 h，直至液相分层；
4 ℃， 8000 rpm，离心 30 min，用移液枪轻轻吸取上层水相，再取等体积水加入余下酚相，放置于水浴锅中， 68 ℃水浴过程中并持续振荡混匀 30 min，放置于 4 ℃冰箱，并于冰上冰浴约 2 h，直至液相分层；
4 ℃， 8000 rpm，离心 30 min，用移液枪轻轻吸取上层水相；
合并前面步骤中得到的所有水相，再加入等体积的 90％苯酚溶液于 68 ℃水浴中振荡混匀 30 min，放置于 4 ℃冰箱，并于冰上冰浴约 2 h，直至液相分层；
4 ℃， 8000 rpm，离心 30 min，用移液枪轻轻吸取上层水相，余下酚相再重复上述步骤；
收集最后得到的所有水相置于透析袋中，用蒸馏水透析 48 h，每 8 h 换水一次；
将透析袋中水相全部转移至 10 mL 离心管内，向其中加入 6 倍体积的无水乙醇，再用 NaOH（5N）调 pH 至 8.0~9.5 之间，放置 4 ℃冰箱，冰上过夜沉淀；
次日 4 ℃， 8000 rpm，离心 30 min，沉淀即为获得的粗制脂多糖。

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配制银染液：
向 280 mL 超纯水中加入 5.6 mL 的 1M NaOH 溶液和 4.8 mL 的25%氨水，再向溶液中逐渐滴加 20%的 AgN03溶液 8~9 mL，直至溶液开始出现沉淀时，立即用氨水进行回调，直至溶液呈现透亮的浅黄色，即停止；

配制固定液：
固定液 400 mL（分别量取超纯水 270 mL，冰乙酸 30 mL，异丙醇 100 mL，混匀）；

配制氧化液：
准确称取高碘酸 2.118 g，溶解于 278 mL 的超纯水中；

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银染法：
① 将电泳结束后的 SDS-PAGE 胶浸于固定液中，放置于水平摇床上缓慢摇动 2h，固定完后弃掉固定液；
② 将 SDS-PAGE 胶浸没在 7.5%冰乙酸中，清洗 30 min，洗两遍；
③ 将 SDS-PAGE 胶浸没在氧化液中，氧化 5~6 min，再用超纯水清洗每次 30 min，清洗 3~4 次；
④ 将 SDS-PAGE 胶浸没在银染液中，银染 10 min，银染结束后弃掉银染剂；
⑤ 用超纯水清洗 SDS-PAGE 胶，每次洗 5 min，总共洗三次，每一次清洗过程中均用手左右晃动；
⑥ 配制显色液：准确称取柠檬酸 0.0125 g，溶解于 500 mL 超纯水，再向该溶液中加入 35%的甲醛溶液 250 µL；
⑦ 将 SDS-PAGE 胶浸没在显色液中，用手左右晃动，直至出现清洗条带为止，弃掉显色液，将胶浸于终止液(1%的冰乙酸)中；
⑧ 对银染结束后的 SDS-PAGE 胶进行凝胶成像。

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01035：
固相筛选每轮投入量是2×10^11cfu
封闭液用1%明胶
LPS包被量为：10-7.5-5-2.5ul/孔
HRP-标记的抗M13二抗，1:5000倍稀释

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得到一株纳米抗体，进行原核表达
融合蛋白CTB-Nb，可溶性表达，蛋白大小约为29KDa。
热稳定性通过ELISA进行评价，65℃60min能保持63.7%的活性。