结核分枝杆菌的纳米抗体 Mycobacterium tuberculosis

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01002：
结核分枝杆菌 Rv0733-6His 抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定
结核分枝杆菌H37Rv菌株中的Rv0733抗原基因名为adk，抗原名为腺苷酸激酶，分子量约20kda，对该菌在细胞内的核苷酸代谢发挥作用。

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国内临床针对临床上用来辅助结核病诊断的3种抗原：
① 定位在结核分枝杆菌质膜上的 38 ku 磷酸盐转运蛋白，适合活动性肺结核诊断， 检测敏感性为 91% ， 特异性为 97% ；
② 16 ku 的结核分枝杆菌主要蛋白抗原 63( major protein antigen 63 of tuberculosis， MPT63，又名 Rv2031c) 抗原，种特异性抗原 ，检测敏感性未52.5% ， 特异性为93. 3%；
③ 分枝杆菌细胞壁的属特异性抗原脂阿拉伯甘露聚糖( lipoarabinomannan， LAM)，检测敏感性为93%，特异性为 100%。
3 种抗原的血清学应答水平作为结核病的辅助诊断指标。

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01001
结核分枝杆菌H37Rv菌株Rv1908c、Rv0733、Rv0899、Rv1411c 和 Rv3914
5 种结核分枝杆菌分泌性抗原作为血清学诊断抗原筛选对象。
① Rv1908c基因名为katG，抗原名为过氧化氢酶-过氧化物酶-过氧亚硝酸酶T ( catalase-peroxidase-peroxynitritase T) ，分子量约 80.57 ku，对分枝杆菌在巨噬细胞内存活有重要作用;
② Rv0733基因名为adk，抗原名为腺苷酸激酶，分子量约20.09ku，对该菌在细胞内的核苷酸代谢发挥作用;
③ Rv0899基因名为ompA，抗原名为外膜蛋白A，分子量约33.54 ku，是维持细菌完整性的结构蛋白;
④ Rv1411c基因名 lprG，抗原名为保守脂蛋白，分子量约 24.55 ku，功能未知;
⑤ Rv3914 基因名为 trxC，抗原名为硫氧还蛋白，分子量约 12.54 ku，可参与多种氧化还原反应。
5 种抗原经原核表达、纯化，包被酶标板，采用间接 ELISA 方法比较活动期结核病患者组和健康对照组血清中分别与5种结核分枝杆菌 抗原反应的IgG水平，探讨作为活动期结核病新的血清学标志物的可行性。

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Rv1908c、Rv0733 和 Rv0899作为检测抗原在ELISA实验中，检测健康体检者和患者之间没有显著差别。
但是在细胞水平或动物水平均被证实其突变对于结核分枝杆菌在人体内的长期生存起到相当重要的作用。
当结核分枝杆菌感染巨噬细胞或被巨噬细胞吞噬后， 这些蛋白分子可能才真正开始它们的工作。因此这些抗原可能有助于筛选结核分枝杆菌特异性胞内抗体。

纳米抗体在胞内应用
作为治疗性抗体中和病原体抗原，提高巨噬细胞杀菌的潜力日渐凸显。

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噬菌体库：天然羊驼噬菌体库，多样性大于10^9。
用于筛选Rv0733抗原。
TG1 菌株、XL1-Blue 菌株
三轮筛选鉴定1024个克隆，得到13个阳性克隆，其中10个有独立序列。

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构建pET-22b-v0733-VHH-IFH 原核表达载体， 进行纳米抗体的原核表达。
扩增VHH序列的引物用：
上游：TAATTAGCTAGCGGAGACGGTGACCTGGGT
下游：AATAAGGATCCGATGGCCCAGGTGCAGCT

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Ｒv0733-VHH-Fc-6His 融合抗体的原核表达与纯化:
① 携带 pET-22b-Ｒv0733-VHHIFH 质粒的菌种接种 200 mL LB 培养基 ( 含 50μg /mL 氨苄青霉素) ， 37 ℃ 振摇至 A600 为 0.6 ;
② 加入终浓度为 0.1 mmol /L的 IPTG，30 ℃ 振摇 6h，进行诱导表达；
③ 7000 g离心3 min， 收集细菌沉淀; 用20mL细菌裂解液(50 mmol /L NaH2PO4，300 mmol /L NaCl，10 mmol /L 咪唑，pH= 8) 重悬菌体沉淀， 超声法充分裂解细菌;
④ 4℃， 8000g 离心30min，取上清，为粗提蛋白，（可溶性表达）。经 0.45 μm 过滤器过滤后， 加入 1 mL 镍亲和琼脂糖微珠， 4 ℃ 旋转混合过夜; ⑤ 次日用含 20 mM咪唑的PBS缓冲液( 50 mmol /L NaH2PO4, 300 mmol /L NaCl，20mmol /L 咪唑，pH 8.0) 充分洗涤，离心弃上清， 以去除未与镍亲和琼脂糖微珠结合或结合不紧密的杂蛋白;
⑥ 最后用含 300 mmol /L 咪唑的 PBS 缓冲液洗脱目的蛋白；
⑦ 将洗脱纯化的蛋白经超滤离心管超滤， 去除咪唑等小分子， 再用 0.22 μm 过滤器浓缩过滤， 滤液加入终浓度为 40% 的无菌甘油， 制成纯化 Ｒv0733-VHHFc-6His 蛋白样品， 置-80 ℃ 冰箱备用。

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免疫荧光检测Rv0733-VHH-Fc-6His 与胞内 BCG（卡介苗）的结合能力：
① 将人白血病单核 THP-1 细胞以 3 × 10^6 细胞 /孔的密度接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板内， 加入终浓度为 50 ng /mL 的 PMA（佛波酯），孵育 24 h 后， THP-1 细胞分化为巨噬细胞；
② 培养于 7H9 液体培养基中的 BCG 用完全 1640 培养基洗后， 用无菌玻璃珠充分研磨。以 10：1( 细菌：细胞) 的比例用 BCG 感染分化后的 THP-1 细胞；
③ 在 37 ℃ 5% CO2 孵箱中放置 10 h 后， 用 PBS 洗 3次， 4% 多聚甲醛固定30min， PBS清洗后， 用含0. 5% Triton X-100 的 PBS 透化 30 min， 用 ImageiT FX 信号增强剂封闭 30 min；
④ PBS 洗后， 加入1：500稀释的 Ｒv0733-VHH-Fc-6His 一抗室温孵育 2 h；
⑤ PBS 洗后， 加入 1：1000 稀释的Alexa 594标记的羊抗人 IgG 二抗室温孵育 1 h；
⑥ 清洗后，干燥的爬片用含 DAPI 的中性树胶在载玻片上装片， 指甲油封片。

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01001中：
Rv0733-6His 抗原包被酶标板分别检测 34 例结核患者和 35 例健康体检者血清，未能检测到血清中IgG，说明结核患者体内不能激发显著的体液免疫， 因此其虽然为膜抗原， 但不适合用作临床诊断标志;
分析原因：
结核分枝杆菌在宿主体内主要寄居在巨噬细胞内， 该抗原对胞内结核分枝杆菌核酸的生物合成起重要作用。
本研究设想若能筛选到 Ｒv0733 抗原的 VHH 抗体，利用其分子量小、渗透能力强的特性来中和胞内菌产生的抗原， 或可提高吞噬细胞清除胞内菌的能力。

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01003 专利
结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫，体液免疫强度似乎不够，产生的抗体难以杀灭细胞内的菌体，但是血清学诊断具有价值。
诱导机体产生抗体的结核抗原成分复杂，有脂阿拉伯甘露聚糖抗原，Ag85复合物，38kd蛋白，A60抗原，16kd蛋白，MPT64，ESAT6，CFP10，MTB48.