新冠病毒

青花瓷

中和抗体相关文献

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1. Ahmad等筛选到Sb16, Sb45, Sb68合成纳米抗体，和RBD区结合。其中Sb45的亲和力最高，达到0.038uM。
Sb45和Sb16有竞争性结合
Sb68则和Sb45无竞争性结合。
Sb68干扰ACE2与RBD相互作用的机制很可能是由于和hACE2的N322-和N546链聚糖的空间碰撞。Sb68–RBD和ACE2–RBD之间存在空间位阻。

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2. Dong等从天然库/合成库筛选到针对S1蛋白RBD区的特异性纳米抗体。经过fortebio分析，选取三个不存在竞争表位的纳米抗体，进行人源化，融合到IgG1 Fc区域，构建纳米抗体三抗。利用5个缺失型的突变株对抗原结合表位进行预测，确定在S1 RBD区有两个中心结合区，N端有(del1: 340–358)，ACE2结合表面 (del3: 448–472, del4: 483–494, del5: 498–505).
构建的三抗能覆盖上面所有的抗原结合表位区域，此外还可能同时结合RBD蛋白内部的一些表位，从而增强亲合力，和抗原的结合能力，阻断S1/ACE2结合，中和活性增强，减少ADE效应，对更多的病毒突变株具有结合活性。
因为具备这些特征，三价纳米抗体能在低剂量时起治疗作用，并且对人的毒性作用不大。
三价的VHH-Fcs 3F–1B-2A和RBD蛋白的亲合力KD为0.047 nM，和单抗混合使用相比较，多价的纳米抗体更为有效，抗体蛋白不易产生聚集，能大规模生产纯化，热稳性很好，适合作为治疗抗体。

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从天然库/合成库中筛选了80多个针对SARS-CoV-2 S1蛋白的纳米抗体，其中19个具有阻断 S/ACE2结合的功能 。从中挑选具有协同阻抗作用的抗体对进行双特异性抗体的构建，比单抗的阻抗作用要强。
根据双特异抗体的特性和计算机辅助建模预测，推测加入第三个VHH能进一步提高抗体的协同作用，

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筛选新冠纳米抗体的实验流程：

(1) 从65个美洲驼血中分离PBMC，提取RNA，反转录为cDNA，通过两轮PCR，构建噬菌体纳米抗体库。合成的纳米抗体库是将CDR1-3区插入到一个人源化的VH载体骨架中。
(2) SARS-CoV-2 S1-鼠Fc融合蛋白作为抗原，对纳米抗体库进行筛选。首先，用抗-鼠Fc的抗体包被板子固定S1抗原，进行三轮的筛选，每轮抗原包被量递减，用ELISA进行鉴定，板子包被SARS-CoV-2 S1蛋白，能结合上的VHH通过抗c-Myc抗体，以及HRP-链霉素进行信号放大，最终得到69种纳米单抗。
(3) ACE2竞争ELISA实验，板子上包被SARS-CoV2 S1抗原，加入特异性的VHH和生物素化的ACE2。分析两种蛋白对S1的竞争性结合，最终得到9种能阻断S1/ACE2结合的VHH。
(4) 对9种抗体配对，再次进行ACE2的竞争ELISA实验，结果显示有两对协同作用的抗体，能加强对S1/ACE2的阻断作用。
(5) 设计成双特异性纳米抗体或者三特异性纳米抗体，和Fc段进行融合，设计过程利用CAAD进行VHH-Fcs的优化. 单抗1B/3F或者双抗(1B-3F) 阻断S1/ACE2的剂量-效应关系。
(6) 纳米抗体-Fc潜在的治疗机制
(7) 人源化纳米抗体单独或者组合探针作为诊断试剂的潜能。

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3 Margulies筛选得到的合成纳米抗体S14, S16, S45, S68，通过X-ray晶体结构和结合实验分析能和ACE2-RBD界面产生相互作用，有很强的中和作用。 原核表达得到纳米抗体，SRP测定抗体亲和力。这几个纳米抗体都呈现出有一个二硫键连接环，起到稳定两个β-折叠的作用
Sb16和Sb45的CDR2 以及 CDR3和RBD结合。而Sb14使用更多的非cdr残基与RBD相互作用。Sb68也使用了1个CDR1，4个CDR2和9个CDR3与RBD形成结合界面。此外，这些二价或者多价的纳米抗体显示出显著的中和能力。突变病毒株Alpha、Beta、Gamma和Delta的RBD区和ACE2的结合亲和力增强，这几株抗体没有检测到和产生点突变的K417 N, E484K，N501Y的RBD蛋白之间的结合活性，显示出抗体对突变病毒株没有很好的中和活性。

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4. Xu等从羊驼，转羊驼，单峰骆驼和双峰骆驼基因的小鼠中分离出两组抗-RBD抗体，组1的抗体能够识别传统人抗难以识别的RBD高度保守序列，并且能有效规避抗原漂移。组2的抗体主要是聚焦于RBD-ACE2结合界面，并不能中和携带E484K或N501Y点突变的SARS-CoV-2病毒株。组2的抗体对于三聚体变异株同样保留有百分百的中和活性。提示利用多价纳米抗体通过两种不同的机制可克服病毒株突变体，一是提高ace2-结合区域的亲合力，另一个是识别传统人抗不能接触到的抗原表位。尽管新的S新冠突变株持续出现，纳米抗体还是很有希望的预防工具，降低死亡率。

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5. Custodio等人利用纳米抗体合成库筛选和新冠抗体产生中和活性的纳米抗体，不需要进行免疫，所以筛选时间不需太长。一轮筛选后，得到85个结合体，其中有6个和纳米抗体有很高的亲合力， Sb12（24.2nM)、Sb23(10.6nM)、 Sb42(5.0nM)、Sb76(58.1nM)、Sb95(43.9nM)、Sb100(38.7 nM)，其中Sb23的中和活性最好(IC50=0.6 μg/mL)。
Sb23和RBD的亲和力要高于ACE2和RBD的结合力，Sb23和RBD蛋白的ACE2-结合位点也能结合，通过空间位阻抑制ACE2和RBD结合。
Sb23能结合刺突蛋白的两种构象，“1-up”和“2-up.” The “2-up” shape allows epitopes to be accessed.
FAB-C105是一种常规抗体，和Sb23进行比较， FAB-C105和Sb23与RBD之间有部分重叠的识别位点表位，Sb12和Sb23之间 没有竞争表位，两者结合使用，能提高和RBD之间的亲合力。

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6. Esparza等分离出13个结合新冠RBD的纳米抗体，能阻断RBD-ACE2的结合。 NIH-CoVnb-101至NIH-CoVnb-113 。文中用到一个新颖的筛选技术，在筛选得到的抗体中，NIH-CoVnb-112亲和力能达到4.9nM，比之前所有报道中出现的纳米抗体亲合力都要高。
在假病毒中和实验模型中，NIHCoVnb-112能有效阻止病毒传递。并且对于三个有RBD突变的变异株同样有效。
文中建议可以用该纳米抗体采用吸入式疗法，经济，方便，安全有效。

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(a) 新冠刺突蛋白RBD区和肺上皮细胞表面的ACE2受体结合。治疗抗体的目标机制就是阻断刺突蛋白和人ACE2受体的结合。(b) 用纯化的新冠2刺突蛋白对成年美洲驼进行免疫5次，周期28天，最后一次免疫后的一周，取血分离B细胞，构建库容大于10^8的纳米抗体噬菌体库。进行免疫筛选，获得特异性的纳米抗体。
(c) 纳米抗体和RBD:ACE2结合界面能作用，阻断了RBD和ACE2之间的作用. (ci) ACE2被包被在一个标准的放射免疫分析管中，用非特异性蛋白进行封闭。生物素化的rbd，与纳米体噬菌体文库进行孵育，然后添加到免疫管中，和包被的ACE2相互作用。没有结合纳米抗体的生物素化rbd，或者不能阻断ACE2结合域的RBD，能和包被的HACE2结合。(cii) 被阻断和ACE2结合的结合有纳米抗体的抗体库溶液取出，通过链霉素包被的磁珠进行分选。 (ciii) 对能阻断ACE2结合的纳米抗体进行了富集，筛选得到的抗体即能和RBD结合，又能和ACE2竞争结合，阻断ACE2受体和RBD的结合。