新城疫病毒F蛋白的纳米抗体

青花瓷

01019
西北农林科技大学
筛选新城疫病毒 (NDV) F蛋白的纳米抗体
以NDVF蛋白中和表位构建诱饵，利用酵母双杂交技术对双峰驼纳米抗体酵母双杂交文库进行筛选，获得 4 株纳米抗体。

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新城疫是由新城疫病毒NDV引起的对养禽业有危害的重要疾病；
NDV属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，其基因组为不分节段的单链负股RNA，大小约15kb，编码6个结构蛋白；
融合蛋白F是病毒囊膜上一个非常重要的糖蛋白，可介导病毒与宿主细胞的膜融合，同时诱导机体产生保护性免疫应答；
针对F蛋白的抗体可有效阻止病毒对宿主细胞核机体的侵袭，是NDV防控中的理想靶标。

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来源于天然纳米抗体酵母双杂交文库。
实验菌株：Y187酵母菌
pGADT7-Rec线性化载体
均来自Clontech
双峰驼安乐死后，采集脾，淋巴结和骨髓，液氮保存备用，之后用液氮进行研磨；
颈静脉取血，抗凝。
100ml的外周血中最终能分离到10^8个单核细胞；提取RNA的浓度为600ng/ul。
NDV La Sota毒株和F48E9毒株

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酵母双杂交系统采用的是clontech公司技术，通过线性化的质粒和VHH片段进行同源重组。
但是文章中看转化效率不高，库容相应的也不算高。

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01019
诱饵质粒
新城疫F蛋白线性中和表位序列 (LLPNLPKDKEACAKAPL) ,合成一段由Linker(GGGS) 串联重复3次的中和表位。
插入到质粒pGBKT7载体中。
转化酵母菌Y2HGold，进行诱饵的自激活和毒性验证。
文库筛选时，取转化菌和酵母库Y187(pGADT7-VHH）做杂交。

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筛选得到4株VHH序列：
插入到pHSIE原核表达载体中，带有HIS-SUMO标签，VHH为可溶性表达。
ELISA检测有很好的特异性和灵敏性。WB实验能识别F蛋白特异性条带。
中和实验显示VHH抗体对病毒感染早期具有一定的中和活性。

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01017:
来源于新城疫病毒F蛋白免疫后噬菌体展示文库。免疫蛋白为原核表达的F蛋白，免疫四次，每次免疫剂量为1mg/ml。
实验菌株：TG1
表达Nb的细胞为HEK293T
噬菌粒载体pMECS用于建库
三免后抗体滴度能达到10^7
250ml的外周血中最终分离到10^7个单核细胞；
毒株为NDV La Sota毒株

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三筛后随机挑取96个克隆，有95个为阳性克隆，测序证实为9种序列。
VHH基因在第37，44，45，47位为纳米抗体标志性亲水性氨基酸序列。

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得到的纳米抗体用间接ELISA进行鉴定，和NDV的F蛋白结合，不和NDV的VP2蛋白结合，特异性比较好（fig2c)。
亲和力鉴定，9株抗体中的6个亲和力较高（fig2d)。
封闭ELISA鉴定，其中5号纳米抗体对阳性血清的封闭作用最强，因此后续选为研究的对象（fig2e)

青花瓷

5号纳米抗体进行Nb-HRR的真核表达，转染HEK293T细胞后，能分泌表达，纯化后进行IFA和ELISA的功能鉴定。
直接ELISA和间接ELISA均显示Nb和新城疫NP蛋白有效结合。