Diarrhea virus 猪流行性腹泻病毒的纳米抗体

青花瓷

01004

内蒙古农业大学
Porcine epidemic diarrhea (PED)

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PEDV属于冠状病毒成员，体外可感染Vero细胞。
基因组为单链，正向RNA，大约有280,000核苷酸组成，有7个编码框，编码四个结构蛋白
分别为刺突蛋白S，囊膜蛋白E，膜蛋白M，和核衣壳蛋白N。

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PEDV刺突蛋白位于病毒表面， 包含病毒的多个中和表位和受体结合域，包括N端的S1蛋白和C端的S2蛋白两种亚单位组成。
在介导病毒和靶细胞的吸附和融合过程中发挥重要作用，对病毒与受体蛋白结合具有关键调节作用， 参与结合细胞受体和膜融合作用， 可以间接调节病毒入侵， 能激发宿主产生中和抗体. S 蛋白是目前新型基因工程疫苗和被动免疫制剂研发的主要靶点。
刺突蛋白为一个多区域结构，能结合猪细胞的唾液酸和氨基肽酶N，显示中和表位主要位于刺突蛋白的S1亚单位，可以作为疫苗研发和诊断试剂的靶标。重组S1蛋白能有效诱导小猪的保护性免疫。

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使用材料：
表达和纯化 PEDV CV777病毒株的刺突蛋白的截断蛋白（444-770位）。
EDV的S蛋白由1383个氨基酸组成， 其中包含信号肽(1-18 aa)、 中和表位(499-638 aa、 748-755 aa、 764-771 aa 和1368-1374aa） 、 跨膜区域（1334-1356 aa)和中间一段较短的胞质区域。
插入到pET-28a表达载体中，转化Transetta-DE3 感受态。表达后用抗HIS抗体进行WB鉴定。
骆驼免疫：
选5周龄骆驼，免疫原为灭活的PEDV病毒，免疫剂量为100000pfu/ml。
一共免疫3次，免疫间隔期为10天，每次免疫取血监测PEDV重链抗体的滴度（IgG2)。

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01005
PEDV 是冠状病毒科、 α冠状病毒属的成员， 是一种单股正链的RNA 病毒， PEDV 基因组全长大约 28 kb， 至少含有 7 个开发阅读框。
S 蛋白对病毒与受体蛋白结合具有关键调节作用， 参与结合细胞受体和膜融合作用， 可以间接调节病毒入侵， 能激发宿主产生中和抗体。PEDV 的 S 蛋白能够识别细胞表面的猪氨基肽酶 N（pAPN）受体， 这种受体主要表达在小肠绒毛及上皮细胞， 使得 PEDV 固定在细胞表面， 进而与细胞融合， PEDV 能抵抗低 pH 和蛋白水解酶的作用， 主要在小肠绒毛上皮细胞内增殖， 将遗传物质侵入细胞并开始病毒基因的复制。 大量细胞受到感染终止分化， 直至脱落、 萎缩。 扰乱小肠内消化及细胞营养物质和电解质的运输， 引起腹泻、脱水， 以致病猪衰竭而亡。

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EDV的S蛋白由1383个氨基酸组成， 其中包含信号肽(1-18 aa)、 中和表位(499-638 aa、 748-755 aa、 764-771 aa 和1368-1374aa） 、 跨膜区域（1334-1356 aa)和中间一段较短的胞质区域。
原核表达使用pET-28a载体，表达PEDV病毒株CV777第444–770位，转化Transetta-DE3感受态，表达后用抗HIS抗体进行WB鉴定。

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纳米抗体序列插入到了pCANTAB-5E载体中，构建后连接产物电转进入TG1细菌中，库容量有3.4×10^6cfu
经过三轮筛选，随机挑选96个克隆进行鉴定，有20个克隆OD值较高。

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将阳性Nb克隆基因连接到pET-25b载体中，该载体含有一段长38个氨基酸的SBP序列，能够和链霉素进行结合。
表达后的蛋白用HIS纯化，蛋白在WB中使用HRP-链霉素进行鉴定。

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对得到的纳米抗体进行活性鉴定。
ELISA板子上包被有病毒S蛋白，每孔1ug。
带有SBP蛋白的空白载体上清样品作为阴性对照。
PBS作为空白对照。
结果1ug的纳米抗体能和S结合。

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免疫荧光：
Vero细胞，加入1ml的PEDV病毒，1ml胰酶(10 μg/ml)混合，37 °C培养1小时；
去除上清后，加入含1%胎牛血清的DMEM培养2天，当CPE达到50–70%时，去除上清，4%多聚甲醛进行固定，固定10min。
加入150ug的纳米抗体S7。
加1：300稀释的FITC-链霉素作为二抗。
DAPI染色，可见细胞核外有荧光信号。