Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters

青花瓷

Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters

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摘要：
CMV启动子/增强子是用于哺乳动物中重组蛋白表达的强启动子，常用于重组抗体的生产。本研究在进行抗体表达载体设计时，将抗体重链和轻链基因转录由一个启动子复合物调控，该复合物由两个启动子组成，两个启动子的5'端距离很近，独立反向分开。但是，这样的表达载体抗体表达量远低于预期。
目的：优化启动子，提高表达量。
方法：制备截断型的启动子复合物，只有一个CMV增强子控制来自两个反向分开的最小CMV核心启动子。由此构建的抗体表达载体转染CHODG44细胞，进行瞬时转染，或者通过位点特异性整合进行稳定表达，分析抗体表达情况。
结果：这种改造后的表达载体能实现高效地表达。经过定点整合后，与全长的双CMV启动子复合物相比，表达量能增加12倍。

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背景摘要：
CMV启动子常用于蛋白表达的真核载体中，在CHO中能实现高表达。但是在表达抗体时，需要两条重链，两条轻链的正确折叠，才能保证抗体的细胞内加工，分泌表达，和具有功能活性。
为了有效提高抗体的正确折叠和分泌表达，需要平衡轻链和重链之间的量。用一个质粒同时表达轻链和重链是个很好的解决途径，本研究中设计了两个反向放置的启动子分别控制轻链和重链的转录，和串联放置两个启动子的载体相比较，降低了对上游启动子对下游启动子转录活性的干扰。将这种双启动子的载体用于抗体的表达时，发现表达量不如预期的高。推测可能是两个启动子单元中的增强子过近而造成的。为了减少这种互相干扰作用，本研究设计了截断的启动子复合物，其中只设一个增强子控制两个反向的启动子核心区。
结果发现，当这种载体通过位点特异性地整合到CHO细胞后，和两个增强子的启动子复合物相比较，截断型的双启动子载体能有效提高抗体表达量高达12倍。

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实验所需材料
CMV序列(GenBank登录号。FJ616285，互补序列173.265-174.902bp）。

ATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCACACCCCTTTGGCTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGCCTATACACCCCCGCTTCCTTATGCTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTATCTCTATTGGCTATATGCCAATACTCTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCCCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACAACGCCGTCCCCCGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAGCGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCCACATCCGAGCCCTGGTCCCATGCCTCCAGCGGCTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACAATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGAGATTGGGCTCGCACCGCTGACGCAGATGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTATTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTC

这段序列标记为-683bp-954bp，包括CMV独特区域(-683bp-545bp)、CMV增强子(-544bp-63bp)、核心聚合酶II启动子(-62bp-1bp)、外显子1(1bp-121bp)和内含子A(121bp-954bp)。

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分泌型碱性磷酸酶(SEAP)表达载体（fig 1b)

SEAP表达载体：包含FRT位点（flp重组靶位，用于在CHO DG44亚克隆DG5.2细胞中FRT位点的定点整合），一个新霉素抗性缺陷基因(缺少新霉素起始密码子，FLP-in系统，Invitrogen，no K6010-02)。

插入CMV启动子复合物的SEAP表达载体：通过ASCI和NheI克隆位点，在SEAP cDNA的上游插入CMV启动子复合物，一种是单启动子加一段抗体重链的前导序列(131bp)，另一种是两个反向启动子分别加上一段抗体重链的前导序列(131bp)以及一段抗体轻链的前导序列(190bp)。（1c，d)。

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用SEAP报告基因的表达鉴定一个启动子和两个反向放置的启动子的转录活性。
实验中发现两个相同的CMV启动子反向放置时，转录活性互相会有抑制效应。

单CMV启动子的表达水平是双CMV启动子载体的2.6倍。
转录起始时需要形成一个大的转录复合物，猜测当两个启动子距离太近时形成空间位阻，影响启动子的转录活性。将双CMV启动子的表达载体分别用BstZ17I和BsrGI进行线性化。
BstZ17I在新霉素下游，线性化后阻止了逆时针转录。
BsrG I在两个启动子之间，线性化后增加了启动子之间的距离。
结果表达水平并无统计学上的差异，说明双启动子通读或者形成空间位阻对于表达水平并无影响。
由此推测可能是两个增强子之间产生了拓扑约束，从而限制了两个启动子复合物的同时形成。核心启动子上转录复合体的形成使DNA从封闭状态转变为打开状态，这就导致了转录复合体下游的正超螺旋和上游的负超螺旋，这种拓扑效应可以影响到上下两个方向的启动子转录活性。

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DG5.2 细胞系和瞬时转染
贴壁细胞DG5.2(早期称为TF214D10.2)来源于DG44细胞。pFRT/lacZeo载体(Invitrogen)通过定点整合插入到CHODG44细胞的基因组热点，导致pFRT/lacZeoLacZ表达失活。
DG5.2细胞接种到六孔板中，每孔细胞数 0.3*10^6 /2ML培养基, 培养24小时后，FugeneHD (Roche, Basel, Switzerland, cat no 04709705001)进行转染，转染的质粒有GFP表达载体(TurboGFP, Evrogen, Moscow, Russia, cat no FP515, 启动子为人EF-1a)，SEAP或者抗体表达载体，48小时后，对蛋白表达进行检测。

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抗体表达载体
基于pcDNA5-FRT(Invitrogen)而构建，该载体包括人抗痘苗病毒抗体的轻重链序列。通过ASCI和NheI酶切位点插入含有抗体轻链和重链的前导序列的启动子复合物。
截短的启动子复合物是通过PCR扩增人CMV启动子序列而得，不包括300bp的stuffer序列，300bp的序列包括~150bp的SV40复制起点和~130bp的pUC复制起点。在扩增过程中，在启动子/前导片段的5'末端加入FseI位点，用于两个启动子与抗体表达载体的三个片段连接反应。

图为

人抗痘苗病毒抗体的表达载体，包括一个重链可变区融合人IgG1恒定区，一个轻链区，一个可供点特异性整合的FRT位点，一个缺陷的新霉素抗性基因，启动子复合物。B和C分别代表第一代和第二代的CMV复合物结构。

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本研究是希望在不改变整体载体设计的情况下，对启动子复合物区域进行改造，从而消减转录干扰的影响，但是也有可能产生新的转录干扰。单增强子能够驱动两个反向放置的核心启动子的转录活性，所以仅有一个增强子存在的情况下，转录干扰情况可能得到缓解。
因此设计了几种启动子复合物。如图，B中的两个启动子复合物，由一个常规CMV启动子和一个截短的小CMV启动子minCMV组成。minCMV启动子截短于增强子下游，由CMV核心启动子、外显子I和内含子A组成(-62bp~954bp)。TCMV-A和TCMV-B的区别在于在TCMV-A中，CMV启动子与轻链前导序列连接，minCMV启动子与重链前导序列连接。在TCMV-B中，CMV启动子与重链前导序列连接，minCMV启动子与轻链前导序列连接。


将截短的启动子复合物和2xCMV启动子复合物分别转染DG5.2细胞进行瞬时表大。结果表明，一个CMV增强子能够驱动两个CMV核心启动子的转录，但2xCMV质粒的表达量显著高于两个含有截短启动子复合物的质粒。

TCMV-A和TCMV-B两个启动子相比较，抗体表达有14倍的差异，通过qRT-PCR对抗体轻链和重链mRNA进行监测。

2xCMV的表达载体，虽然两个启动子完全一致，但是重链比轻链mRNA产量要多。

两种截短CMV复合物中，TCMV-A 重轻链mRNA量之比为4倍，TDMV-B重轻链mRNA量之比为8倍，并且都是minCMV的转录活性要低很多，minCMV和CMV启动子转录活性有比较大的差异。

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CMV启动子去掉独特序列
CMV unique region (-683 bp到-545 bp)
在人类巨细胞病毒中，CMV增强子上游的独特区域能够抑制病毒基因组里位于反方向的UL127基因的转录。第二代启动子复合物的设计去掉了两个启动子的独特区域。两者的区别在于轻链和重链的放置。


两种带有不同启动子复合物TCMV-C以及TCMV-D的抗体表达载体转染DG5.2细胞， TCMV-C和2xCMV两种质粒进行相比，表达水平相似，比TCMV-A 高3倍。TCMV-D和TCMV-B相比较，有13倍的提高。qRT-PCR结果显示

轻重链mRNA的量显示和蛋白表达量很一致，说明启动子的独特序列对增强子有阻碍作用，去掉这段序列后的minCMV启动子能被增强子有效激活。TCMV-C比TCMV-D相比较，轻链的LC mRNA含量要多两倍。
根据图b结果显示，增强子能对双向启动子都具有激活的能力，对于同向的启动子和反向的启动子，转录活性大约为2：1之比。