腺病毒通用晚期表达盒的构建及4型腺病毒右侧末端片段克隆及测序

青花瓷

讨论分为两部分：
1 4型腺病毒右侧末端克隆及测序腺病毒
腺病毒基因组的一大特点是其5 端带有末端蛋白(TP)， 增加了构建克隆质粒的难度。在构建腺病毒克隆时要求去除末端蛋白而不改变末端序列， 尤其是末端颤倒重复序列(ITR)，因为ITR序列和腺病毒的复制密切相关。

青花瓷

去除末端蛋白的方法有酶切克隆法及碱变性法：本研究中用 碱变性法，利用变性、复性来去除末端蛋白。
在①变性、复性腺病毒DNA 片段大小，②复性液浓度，③复性时间等方面进行改进。
发现变性/复性的DNA 片段应尽可能的小， 复性的时间应尽可能的缓慢，这样有助于复性的准确性。

青花瓷

腺病毒DNA的提取
现在已有简单高效的试剂盒使用。详细实验流程可以参考文献
三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析
http://www.soberreading.com/forum.php?mod=viewthread&tid=109&extra=page%3D1

青花瓷

腺病毒载体的进展：第一代腺病毒载体：去除E1、E3区，插入外源基因的长度可达8kb。
第二代腺病毒载体：去除E1、E3的基础上又将E2A突变或者让E4区缺失，插入外源基因的长度可以达到14kb。
第三代腺病毒载体：辅助病毒依赖型腺病毒载体（Helper dependent adenovirus），只含有约500bp的顺式作用元件，缺乏所有编码序列，需要加辅助型载体，用于DNA复制和包装，可以插入的外源基因长达36kb。