The SARS-CoV S glycoprotein: expression and functional characterization

青花瓷

合胞体实验：
合胞体是病毒感染的一种现象，镜下可观察。有的病毒感染了宿主细胞后，会促使宿主细胞和周围的同类的细胞融合，形成多核巨细胞，称合胞体（syncytia）。本文中检测全长S糖蛋白在中性pH条件下能否独立介导细胞融合。
结果显示，两种表达全长S蛋白的真核表达载体pCNA3-S和pSectag2B-S都可以和表达ACE2的细胞进行融合。如图A，
左边为转染S蛋白的细胞和pCDNA3-ACE2-ECTO转染细胞后不能产生合胞体。
右边为转染S蛋白的细胞和pCDNA3-ACE2转染细胞后能产生合胞体。




图B用报告基因β-gal系统来检测细胞融合情况，结果和图A一致。用报告基因检测的实验比较简便快捷，可以用于鉴定影响SARS病毒进入细胞的抑制剂或者机制研究。

青花瓷

对于天然表达ACE-2的细胞，如VERO细胞。因为本底表达量不高，合胞体形成实验和报告基因检测实验灵敏度不够检测到细胞融合的发生。
通过不同荧光分别染色转染后表达S蛋白的HELA/293T细胞（Calcein）以及VERO（CMAC）细胞后，将细胞共同孵育。
通过分析荧光在细胞中的定位，判断细胞融合情况。
分析比较不同的S蛋白表达以及阴性对照质粒在不同pH值下的Vero细胞融合反应，没有明显的实验数据支持细胞发生融合。
说明受体(ACE2）表达量需要较高水平时（如转染ACE2后高表达），对于细胞的融合起重要作用。
另外，当受体表达量较低时，高表达量的S蛋白可能也会促进细胞融合。

青花瓷

定位S蛋白的RBD区，采用细胞结合实验和ELISA检测：将表达S蛋白的上清和Vero细胞共同孵育后，加HRP-标记抗体，加底物显色，测OD值。
如图A，S537可以和VERO上受体结合，与293细胞不结合。
用纯化的ACE2包被ELISA板，进行ELISA检测。

如图，除了S276蛋白，其他S蛋白能和VERO结合，说明RBD区位于272-537之间。进一步定位，用288-303的抗体542，检测到该抗体不能抑制537蛋白和Vero的结合，说明RBD区位于303-537之间。