A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

青龙偃月刀

实验设计--噬菌体展示技术

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试验设计--纳米抗体作为结晶伴侣

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关于进行纳米抗体工作的实验室建设：
至少需要两个单独实验室
一个不做噬菌体，仅做纳米库和分子克隆实验。
另一个用于噬菌体操作，包括噬菌体的扩增和抗体筛选工作。
为减少噬菌体污染，尽量使用过滤的枪头。实验台，仪器，和玻璃器皿每次使用后用次氯酸钠清洗一遍。尽量使用一次性耗材，使用后废弃物置于1%次氯酸钠液体中灭活残存的噬菌体颗粒。

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所用材料和试剂
冰醋酸溶液 (Merck，货号：1.00058.2500)，该溶液具有腐蚀性，需要小心使用，防止吸入，溅到皮肤，眼中。
AEBSF蛋白酶抑制剂 (Carl Roth,货号： 2931.3)
MP琼脂 (Roche, 货号：11 388 991 001)
氯化钙，氯仿，柠檬酸，EDTA，脱脂奶粉，乙醇，甘油，佐剂
菌株
TG1:琥珀突变抑制的菌株，构建和制备噬菌体库。
WK6：表达菌株，用于表达纳米抗体
异硫氰酸胍-硫氰化氢HRP-底物： 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐 ABTS
AP-底物: 4-硝基苯磷酸盐 二钠盐 六水合物(PNPP)
IPTG（不含二恶烷），用于诱导纳米抗体的表达
异戊醇，氯化钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氯化镁，硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化铵，PEG6000
M13辅助噬菌体，卡纳抗性VSCM13
生物素标记蛋白
载体的选择
pMES4 (genbank GQ907248) ，pMESy4 (genbank KF415192)来源于pHEN460噬菌粒。
pMES4展示出的蛋白带有6个HIS标签，pMESy4展示出的蛋白带有6个HIS标签和EPEA标签。
转录受Lac Z启动子调控，葡萄糖抑制表达，IPTG诱导表达。

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LacZ基因广泛用于基因表达调控研究中的一种基因。LacZ基因编码的β一半乳糖苷酶（简称β-gal)是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察．LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，β-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选．例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。
Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列（不编码任何基因），控制着mRNA的转录的起始。
        

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RNaseOUT RNA酶抑制剂 (Life Technologies, cat. no. 10777019)•
醋酸钠.3H2O (Merck, cat. no. 1.06267.1000)•
次氯酸钠
蔗糖
SuperScript II 反转录酶
T4 DNA 连接酶 (1U μl−1)
Trisma base 柠檬酸钠
胰酶
超纯酚：水(3.75:1, v/v)

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配制培养基：
胰蛋白胨 (Duchefa, cat. no. T1332)•
蔗糖 (Sigma-Aldrich, cat. no. G8270)•
LB 液高盐(Duchefa, cat. no. L1704)•
琼脂粉(Duchefa, cat. no. M1002)•
盐酸硫胺 (Sigma, cat. no. T1270)•
酵母提取物 (Duchefa, cat. no. Y1333)

限制性内切酶：
Eco91I (Thermo Scientific, cat. no. ER0391)•
NcoI (Thermo Scientific, cat. no. ER0571)•
PstI (Thermo Scientific, cat. no. ER0611)

DNA 纯化试剂盒：
PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega, cat. no. A1222)•
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, cat. no. 28706)•
QIAquick PCR purification kit (Qiagen, cat. no. 28106)

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生物素标记试剂盒：
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit (Thermo Scientific, cat. no. 21435)•
Biotin Quantitation Kit (Thermo Scientific, cat. no. 28005)

抗体：
Capture select Biotin anti-C-tag conjugate (Life Technologies, cat. no. 7103252100)•
Goat anti-Llama antibody HRP conjugated (Bethyl Laboraties, cat. no. A160)•
Goat anti-mouse IgG Alkaline Phosphatase conjugated (Sigma, cat. no. A3562)•
Mouse anti-His antibody (Abd Serotec, cat. no. MCA1396)

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引物：
CALL001: 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’
CALL002: 5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’
VHH-Back: 5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3’ (PstI)
VHH-For: 5’-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3’ (Eco91I)
MP57: 5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’
GIII: 5’-CCACAGACAGCCCTCATAG-3’
引物合成后，用10mM的Tris-HCl（pH 8.5）缓冲液进行溶解稀释至100uM，dN6随机引物: 5’-NNNNNN-3’ 用10mM的Tris-HCl（pH 8.5）缓冲液进行溶解稀释至 2.5 μg/μl，可以在 −20°C 冻存数年。

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所需耗材：
245 × 245 × 25mm 方盘(Thermo Scientific, cat. no. 240835)
96-深孔板(Thermo Scientific, cat. no. AB-0932)
96孔圆底ELISA板 (Thermo Scientific, cat. no. 249944)
96孔U型底ELISA板 (BD, cat. no. 353077)
离心机 (Eppendorf, cat. no. 5810R)
血液收集管(Terumo, cat. No. VF-109SDK) 血清收集管 (Terumo, cat. No. VF-108SAS)
细胞刮刀 (Costar, cat. no 3011)
1.5和2 ml离心管 (Eppendorf, cat. no. 5430R)
电击杯 (Bio-rad, cat. no.1652103)
离心管(15 ml, 50 ml) (Fisher Scientific, cat. no. 14-959-49B, 14-432-22)
电击仪 (Bio-rad, cat. no. 165-2089)
玻璃珠(2.5-3.5 mm): (VWR, cat. no.2010087)
回转式震荡仪 (Heidolph-instruments, cat. no. 544-12200-00)
孵育箱 4 °C, 16 °C 37 °C