关于纳米抗体的读文献笔记

青龙偃月刀

纳米抗体的理化和生物学性质-高耐热性和稳定性：

在恶劣条件，如在高热、离液剂、存在蛋白酶和极度pH值变性的条件下（如胃液和内脏中），正常抗体会失效或分解，而纳米抗体仍具有高度的稳定性。

比较了鼠单抗和纳米抗体在高达90℃高温长时间处理的抗原结合活性，发现纳米抗体都保持了较高的活性仍能重新获得抗原结合能力，而所有常规抗体在90℃处理后都丧失了活性，发生了不可逆的聚合。

将不同的纳米抗体在37℃放置1周，其抗原结合活性均保持在80%以上，表明纳米抗体在室温下保存相当稳定，比常规抗体更易于储藏和运输。在强变性剂的条件下表现出不易变性或者变性后易复性的特点。

二硫键对纳米抗体结构的稳定和生物活性的保持有重要贡献。

相比传统抗体，单域抗体的变性温度往往可以达到60 ℃ ～ 80 ℃，且构象稳定性高［ΔG( H2O) = 30 ～ 60kJ/mol

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纳米抗体的理化和生物学性质-高抗原结合性，亲和力较高：

纳米抗体独特的结构决定了其高抗原结合特性，研究发现从免疫的纳米库中筛选得到的纳米抗体具有nM级的亲和力，并且特异性好。
传统小分子抗体Fab片段及单链抗体scFv的抗原结合表面常形成凹形拓扑结构, 通常只能识别位于抗原表面的位点，因此纳米抗体VHH单域具有更加广泛的抗原结合力，甚至当靶蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别的位点时，纳米抗体也可以对其进行表位识别。

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纳米抗体的理化和生物学性质-高水溶性、高表达性

SCFV在单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附；

而纳米抗体VHH由于其FR2中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性增加，聚合性减少；溶液中的纳米抗体浓度在达到10mg/ml时也不发生聚合。

而且纳米抗体即使以包涵体形式表达，也很容易复性，这样可以大大提高作为药物的利用率。

因纳米抗体分子量小、结构简单，由单一的基因编码，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用。

常规条件下，在大肠杆菌中纳米抗体的表达量在5-10mg/L。

通过酵母反应器酿造，纳米抗体的产量进一步提高，每公升可达1克的产量。

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纳米抗体的理化和生物学性质-较强的组织穿透性：
纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的组织如实体瘤发挥作用；
多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除，这相对于单克隆抗体组织穿透力差，不易被清除的不足，更有利于疾病的诊断。
纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，这样的特性为脑部给药提供了新方法，有望成为治疗老年痴呆症的新药。

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纳米抗体的局限性和解决办法：　
与传统的抗体相比，纳米抗体的溶解度提高，亲和力增加至亚摩尔级，易于穿过血脑屏障到达目的地。纳米抗体易于用基因工程技术优化、剪接从而工程化地进行改造，比如按照人们的意愿构建融合分子，将纳米抗体和放射性核素、功能性多肽等结合在一起，纳米抗体能够将他们运达靶标，发挥功效。
纳米抗体面临着一些现实的挑战：其中最受争议的问题还是纳米抗体的临床安全性问题，驼源的纳米抗体在体内是否会产生免疫应答以及如何降低其免疫原性关乎纳米抗体能否大规模用于肿瘤的诊断与治疗。
另外，纳米抗体存在半衰期短的劣势，血液清除速度很快, 不利于它所携带的药物发挥作用。需要通过基因技术将VHH 和寿命较长的分子融合在一起, 可以提高Nb 在血液中的存在时间，采取延长半衰期的改造措施，如Fc融合、PEG化、白蛋白融合等。

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纳米抗体的筛选方法--基于噬菌体表面展示技术的筛选
由于不存在传统抗体的轻重链匹配问题， 单域抗体特别适合采用噬菌体展示文库技术进行筛选。噬菌体单域抗体文库一般分为三大类：免疫库、天然库和全合成库。
噬菌体展示技术筛选抗体的流程一般包括以下几点
（1） 抗体基因片段的获取。取羊驼或鲨鱼的外周血， 采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞， 提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR逆转录成cDNA, 采用巢式PCR两步法扩增VHH基因， 最后将VHH基因克隆到噬菌体载体上， 克隆构建完成后可用二代测序的方法来质控文库质量。
（2） 目的基因的淘选。先将噬菌体文库与不带有目的抗原的封闭液共孵育， 进行负选， 减少非特异性反应， 提高抗体淘选的效率。再将抗原固定到固相载体上 （聚苯乙烯板或者磁珠） 进行淘选。淘选一般要进行多轮， 每轮淘选后可采用Phage-ELISA检测， 直到能检测到明显的富集效果。
（3） 抗体的表达纯化， 将目的抗体基因序列克隆到表达载体上， 可以通过原核表达系统或真核表达系统进行表达。

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纳米抗体的筛选方法--酵母表面展示技术

用于抗体展示技术的酵母一般是酿酒酵母，单域抗体是以融合蛋白的形式与Aga2p蛋白融合表达并展示于酵母细胞表面。

酵母展示抗体库的筛选方法一般采用磁珠辅助的细胞分选 （MACS） 和流式细胞分选 （FACS），MACS的主要作用是为了减少非特异性结合，通常会在MACS筛选过后的基础上进行多轮的FACS进行筛选。

相比于噬菌体展示技术， 酵母展示技术既有优势也有不足。

① 存在的优势：

一方面酵母属于真核细胞， 抗体的翻译后修饰与哺乳动物细胞类似， 糖基化后的抗体稳定性高， 同时也避免在哺乳动物表达系统中可能存在的未知情况。

其次酵母展示技术采用的是流式细胞分选的方法， 整个筛选过程的可控性更高。

② 存在的不足：

一方面酵母抗体库的库容一般比噬菌体抗体库的小。

另一方面，酵母展示技术在筛选低聚物的抗原时效果可能不理想， 一个酵母细胞可能同时共价结合多个抗原， 这样便会导致筛选到的抗体的亲和力可能不如预期。

　　
　　
　　
　　
　　

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纳米抗体的筛选方法--基于细菌展示技术的筛选

大肠杆菌除了用于噬菌体文库的构建外， 其本身也可以作为抗体展示的载体。
大肠埃希氏菌E.coli属于革兰氏阴性菌， 除了有细菌内膜， 在细胞壁外还有一层细菌外膜。抗体片段通常展示在E.coli细菌的内膜， 通过抗体的Fc段与膜上的脂蛋白结合， 这种展示和表达方式称为Anchoredperiplasmic expression （APEx、锚定周质表达） .但由于E.coli细菌细胞壁和外膜的存在， 因此细菌需要通透处理成原生质球的形式才能与抗原结合[23-24].利用外膜展示抗体的技术也有被报道过， 例如Salema等将抗体片段展示在EhaA autotransporter （自转运蛋白） 或Intimin（紧密黏附素） 上， 这两种蛋白来源于E.coliO157:H7 （EHEC） 细菌的外膜， 且可以在E.coliK-12细菌中表达和展示[25-27].
革兰氏阳性菌中的肉葡萄球菌Staphylococcuscarnosus也可以用于抗体展示， 该方法是通过肉葡萄球菌的staphylococcalprotein A蛋白的细胞壁锚定区域 （Cell-wallanchoring domain） 将抗体片段从细胞膜内转运到膜外并锚定在细胞壁上。
细菌展示技术的筛选方法一般采用流式细胞分选 （FACS） 的方式， 同时也会结合磁珠辅助的细胞分选 （MACS）。

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纳米抗体的筛选方法--基于核糖体展示技术的筛选

包括三个方面：通过PCR及重叠延伸PCR扩增目的基因DNA文库，进行模板构建；体外转录和翻译，即于具有偶联转录-翻译的无细胞体系中孵育，由于转录产物 mRNA缺少终止密码子，在翻译进程中核糖体会停滞于mRNA的3-末端形成“mRNA-核糖体-蛋白质”三元复合物；亲和筛选及筛选效率的确定，通过固相或液相筛选从翻译好的文库中筛选出特异的的复合体，再通过RT-PCR扩增进行文库构建，进行下一轮的筛选和富集，经过多次富集，最终获得高特异性和高亲和力的目标分子。

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纳米抗体的筛选方法--杆状病毒表面展示技术
该系统以杆状病毒为载体，代表性载体包括AcMNPV和BmNPV。
外源基因插入到病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间，或插入到囊膜糖蛋白gp64，与衣壳蛋白或囊膜蛋白进行融合表达并展示于病毒粒子或感染细胞（昆虫细胞或哺乳动物细胞）表面，从而筛选到表达特异目的蛋白的杆状病毒粒子。
杆状病毒由于其基因组较大，因而可容纳大片段外源基因的插入并能高效地表达和展示。同时，作为一种真核生物展示系统，可以对外源蛋白进行有效的糖基化及二硫键异构化等翻译后修饰，尤其针对高等真核蛋白和分泌蛋白，需要特异的翻译修饰后加工才能有效折叠和保持其天然生物活性。