blinatumomab博纳吐单抗

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Blinatumomab于2014年底获得美国FDA批准，用于治疗费氏染色体阴性的前体B细胞急性淋巴细胞白血病，于2015年在欧盟注册。

Blinatumomab 是一种基于BITE技术的双特异性抗体，由两个只含有可变区scFv通过多肽连接而成，一个靶向肿瘤细胞表面的CD19抗原，另一个靶向细胞毒性T淋巴细胞表面的CD3受体。临床试验已经证明，Blinatumomab在极低浓度（~10—100pg/mL）下，依然可以召集T细胞杀伤肿瘤细胞，但是由于Blinatumomab的单链结构，缺乏Fc段导致药物在体内半衰期很短，实际使用时需要额外配备连续输液装置。

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CD19单链抗体基因来源于HD37鼠杂交瘤细胞。
CD13单链抗体基因来源于TR66鼠杂交瘤细胞

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通过融合PCR的技术将几段基因进行融合，最终克隆到真核表达载体，电转CHO细胞，利用HIS标签进行纯化：

DIQLTOSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVOLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMOSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQ QWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH

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WB检测，和预期大小一致：

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分离的淋巴细胞，去除CD19-阳性细胞，不进行预刺激，作为效应细胞。
CD19-阳性细胞系作为靶细胞 (Raji, Blin I, Daudi,BJAB, and SKW6.4)
加入CD3×CD19双抗，检测效应细胞对靶细胞的裂解能力。
加入CD17-1α×CD3双抗作为对照。
不加效应细胞，不加抗体的靶细胞作为自发裂解组。
加入TritonX-100，能最大程度裂解细胞。

可以观察到CD3×CD19双抗能有效引导效应细胞裂解靶细胞，说明双抗分子有召集效应细胞杀伤靶细胞的能力。

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对双抗CD19×CD3招募T细胞杀伤靶细胞的竞争作用。
使用了两种单抗(A) 抗CD-19单抗HD37，以及(B) 抗-CD3单抗(OKT-3)进行处理后，能完全抑制双抗CD19×CD3招募T细胞杀伤靶细胞的竞争作用。而其他无关抗体，如抗CD-22单抗则对双抗介导的细胞杀伤作用完全不起作用。
说明双抗介导的细胞杀伤作用有抗原特异性。

黄帮主

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Blinatumomab生产工艺早期尝试进行原核表达，但是一直失败。
改用CHO细胞进行真核表达，在真核细胞中，重组分泌蛋白在内质网中能得到正确折叠，释放到细胞培养基中。
在培养基中能检测到单倍体和二倍体的Blinatumomab单抗存在。
单倍体的蛋白在靶细胞不存在的情况下，不会对细胞表面表达的TCR进行下调，激活T细胞，
二倍体的蛋白和单倍体蛋白相比较，产生数倍的细胞毒性，作为药物使用时不便于定量。
因此在生产工艺中，只有单倍体得以纯化和用于治疗。
Lonza制备时，生产规模为2000L。
和传统单抗相比较，用CHO细胞表达blinatumomab的量要至少低50倍。不过因为双抗的高效性，使用量只用低的毫克级即可。