肉毒毒素A的纳米抗体

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多克隆的phage-ELISA结果：

ELISA板包被100ng的BoNT/A或者BoNT/A-DTT
每孔加入的噬菌体量为10^11个噬菌体。



小鼠体内保护性实验，显示噬菌体库和肉毒毒素提前混合后，腹腔注射小鼠，10LD50/50LD50基本上都能有效保护小鼠。

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单菌落PHAGE-ELISA实验：
根据实验结果挑选到15个VHH抗体
小鼠体内保护实验，用10^11噬菌体和毒素预混合后，攻击小鼠。
结果显示四株抗体 (B10, C10, B11, G3) 能完全抵抗10LD50的攻击，其中B11和G3能完全抵抗50LD50毒素的攻击。

并且由BoNT/A-DTT筛选得到的抗体显示出更强的中和活性。
将B11和G3噬菌体进一步梯度稀释，和10LD50毒素进行预混，攻击小鼠。
浓度高的B11和G3能有100%的保护作用。

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改造VHH，提高保护活性
两个VHHs通过(Gly4Ser)3连接到pET30中。差不多有30kda
另外一种方式将VHH连接到鼠Fc段，转染CHO细胞进行表达。差不多有40kda。通过延长抗体半衰期，增加抗体的保护效力。

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SDS-PAGE结果显示各表达蛋白大小和预期一致。WB结果显示两个抗体B11-fc和G3-Fc均和肉毒毒素结合，和兔血清结果一致。
两个抗体均和毒素的重链结合
毒素重链大小约为100kda，代表受体结合域。

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BIaCORE检测两个抗体和(BoNT)/A或者BoNT/A-DTT的结合活性。

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体内保护实验：
单体，双体，以及和FC融合的各种形式的VHHs。和5 LD50 BoNT/A提前孵育，腹腔注射小鼠。
单体形式的VHH，即使用最大量100ug只能起到部分保护作用，10ug时完全没有保护作用。
双体形式的VHH，保护效果有所提高，其中B11-双体在100ug能起到完全保护作用，低至1ug才没有保护作用。
G3-双体在100–20 μg时起保护作用，10ug没有保护作用。
最好的结果，是VHH-FC，其中G3-FC在0.1ug时才不能起到完全保护作用，B11-Fc低至0.001ug时依旧能起到完全保护作用。


评价几种类型的 G3, B11, G3双体, B11双体, G3-Fc, B11-Fc在小鼠体内的血液清除力。
单体，双体，或者FC融合蛋白每组设置5个六周龄的雌性Balb/c小鼠，尾静脉注射100ug/只。
在注射后0, 1, 4, 24, 48, 96, 168, 240, 336 h取面部血，分离血清，冻存在−20 °C，ELISA检测各样品中抗体的浓度。
G3, B11单体,还有B11，G3双体在注射后1个小时，血清中的抗体浓度降到只有起始的10%
而 B11-Fc，G3-Fc 在注射后96 h ，血清中浓度约为起始的10%。两周后，血清中抗体浓度还残余有1%，和别的实验室报道一致。

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融合有Fc片段的VHH保护效力最好，在实验结束后依然存活。结合血液清除实验，B11-Fc和G3-Fc抗体在血液中第14天依然有残留。
所以对保护实验中存活的小鼠再次进行毒素的攻击，观察100LD50对小鼠的保护作用
100–50 μg VHH-Fc 免疫组依旧有100%的保护作用。
20–10 μg VHH-Fc免疫组(clone B11-Fc) 有部分保护作用(75–25%)  G3-Fc没有保护作用。

另外，检测了抗体对毒素的预防和治疗作用，在10LD50毒素腹腔注射攻击前或者后的1小时和3小时，注射抗体。
结果除了攻击后3小时在注射抗体组不能起到保护作用外，其他三组均能达到100%的保护作用。

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BoNT是一个强致死性毒素。
血清疗法是一种有效的治疗方案，特异性抗体也是用于中和肉毒毒素的有效手段。

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总结：本研究中采用了含有少量HA的BoNT/A类毒素作为免疫抗原和筛选抗原。
实验中发现的一些小现象，有中和活性的抗体并不一定是在PHAGE-ELISA中显色最深的样品。
最终挑选了两株有中和活性和保护效力的抗体B11和G3，对抗体进行改构，制备成双体或者加FC段，半衰期也得以延长。

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两株抗体在添加FC段后保护效果提高了至少1000倍。
其中G3-Fc的ED50为0.01ug。
两株抗体能起到预防和紧急治疗的作用。