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青龙偃月刀

4-1BB蛋白免疫羊驼后，构建纳米抗体库，用人源和猕猴源的4-1BB蛋白进行库的筛选
最终从筛选到的一株抗体进行人源化
L-YR-16

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VHH抗体和Fc段进行融合表达，其中Fc段进行LALA的点突变，以去除Fc效应功能。

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HZ-L-Yr-16-Fc能和人源或者猿类来源的4-1BB过表达的CHO细胞产生剂量反应关系。而Urelumab只和人源4-1BB表达的细胞结合。说明和猿类4-1BB无交叉反应。
ELISA结果显示HZ-L-Yr-16-Fc和人4-1BB特异性结合，而和其他TNFR超家族成员不结合。

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细胞阻断实验抗体和CHO-hu4-1BB共同孵育30min，加入生物素化的4-1BB配体，孵育30min。
Antibodies were incubated with cells for 30min, followed by incubation with biotinylated human 4-1BB ligand (ACROBiosystems) for 30min at room temperature. The cells were washed and subsequently incubated with Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SA-PE) (ThermoFisher) at 4°C for 20min. Fluorescence signals were determined on a CytoFlex system and results were analyzed using GraphPad7 software.Biotinylated human PD-L1 (ACROBiosystems) was incubated with a concentration gradient of antibodies for 30min. The mixtures were added to CHO-huPD-1 cells and incubated for 1hour at 4°C. The cells were then stained with SA-PE for 20min. The fluorescence signals were determined on a CytoFlex system and results were analyzed using GraphPad Prism software.

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Fc改造产生没有Fc效应的抗体FcγR和补体参与的免疫应答可能影响某些抗体的疗效，因此可能需要一些Fc无效或沉默的抗体。 例如，以阻断细胞表面受体或细胞因子为目标的抗体是不需要Fc效应功能的，反之可能是有害的。特别是对于需要目标细胞低损耗的免疫检查点抑制剂抗体，这一点尤其重要。目前，许多临床批准的抗癌检查点抑制剂主要是天然低Fc效应功能、无Fc或Fc沉默的抗体。

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大多数TNF-α超家族成员，如4-1BB，由四个富含半胱氨酸的区域组成（CRD）
Urelumab和CRD1区结合，显示了强大的激动剂活性，能诱导肝毒性。
Utomilumab和CDR3，CDR4区结合，相对安全但是和4-1BB结合能力有限。
单价特异性激动型抗体可能会呈现一个效力和毒性之间的线性相关关系。
解决的方法可以有优化FcγR和肿瘤细胞上富含的FcγR受体之间的结合
肝毒性是其面临的主要问题，双抗有望增强其药理作用，同时降低肝毒性。

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抗 4-1BB 激动性抗体可以诱导 CD8+T 细胞释放更多的效应分子，增加增殖，减少 CD8+ T 细胞的凋亡，从而增强抗肿瘤免疫力。

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细胞结合实验CHO-hu4-1BB 表达人4-1BB或者人PD-L1蛋白的细胞和一系列稀释梯度的抗体孵育30min。
清洗细胞后，再和PE-山羊抗人Fc抗体进行4℃孵育30min，流式分析染色阳性的细胞。

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细胞阻断实验：抗体和表达4-1BB的细胞共同孵育30min。
再加入生物素化的人-41BB配体，常温下孵育30min。
清洗细胞后，4℃，和R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素共同孵育20分钟。
流式检测荧光信号阳性的细胞。
生物素化的抗人PD-L1抗体和不同稀释度的抗4-1BB抗体混合孵育30min。
加入到表达人PD-1细胞，4℃，孵育1小时。
加R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素共同孵育20分钟。
流式检测荧光信号阳性的细胞。

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筛选到具有阻断PD-L1功能PD-L1特异性单域抗体
用PD-L1免疫羊驼，建库筛选后得到一株特异性单抗C-Ye-18，人源化，和LALA突变的Fc段进行融合细胞结合和阻断实验证实C-Ye-18能和细胞表面的PD-L1结合，和PD-1之间发生竞争结合关系。
体内实验表明人源化的HZ-C-Ye-18-Fc能有效控制hPD-L1 敲入肿瘤模型小鼠的肿瘤生长。

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原代T细胞激活实验
在NUNC细胞平皿上加抗CD3的抗体OKT-3 ，提前进行孵育2小时，包被上OKT-3 。人PBMCs中分离原代T细胞
系列稀释的4-1BB抗体以固相或者液相的方式和T细胞共孵育4-5天。
细胞上清中ELISA检测IFN-γ分子表达水平。
同时设置PD-L1阴性和PD-L1阳性细胞和T细胞进行共孵育于提前包被OKT3和待测抗体的细胞皿中。
37℃孵育2天后，ELISA检测细胞上清中IL-2表达水平。