Llama-Derived Single Domain Antibodies to Build Multivalent, Superpotent

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帕利珠单抗(Palivizumab，商品名Synagis)是靶向呼吸道合胞病毒RSV的人源化单抗，属于儿科领域的“重磅药”。帕利珠单抗可通过结合病毒表面上的RSV融合蛋白而阻断膜融合过程，也可以阻止被RSV感染的细胞间的融合过程，该抗体药物主要用于预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染。
Wu等人应用定向进化方法来改善帕利珠单抗与RSV F蛋白的结合率（kon）和解离率（koff），并发现通过增加kon来提高亲和力可以改善单抗IgG形式的病毒中和作用，但是在提高抗体亲和力的同时需要同时充分考虑抗体的PK特性和组织的生物利用度。

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RSV微中和实验：
纯化的VHH蛋白用于中和RSV的A和B型毒株。
RSV Long毒株(A型），和ATCC VR-1580 (B1型)在HEp-2细胞上进行培养，滴定。
HEp-2 cells接种到96孔板中，每孔1.56×10^4个细胞。
RSV病毒株和经过系列稀释的VHH进行提前孵育，总体积为50ul，37℃作用30min。
感染HEp-2细胞，作用2个小时。再加入0.1ml的细胞培养液。
作用于72小时后，用80%冷丙酮进行固定，4℃作用20min。
The presence of the F-protein on the cell surfacewas detected in an ELISA type assay.
固定的HEp-2细胞用2% BSA in PBS进行封闭，作用1小时，加兔源的抗F蛋白多抗，或者单抗Synagis，加HRP标记的山羊抗兔二抗或者HRP标记的山羊抗人IgG。
RSV-D3, Synagis Mab, Synagis Fab和不相干的VHH作为对照。

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构建和纯化VHH双价或者多价蛋白：
将纳米抗体序列插入到C末端含有 c-myc和His6标签的表达载体pAX051或者pAX100中。
通过融合PCR将2-3个相同的或者不同的纳米抗体序列融合在一起，构建多价或者多特异性纳米抗体。
LINker的长度从9-35不等，双特异性纳米抗体中的两个抗体方向一致，诱导表达后，进行HIS纯化。
取0.5-1mg进行电泳跑样。

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SPR测亲和力实验：
① 检测VHH针对流感H5的亲和力实验和表位分析实验
CM5芯片上通过胺偶联 2,000RU的 稀释在pH 5.5的醋酸钠中的流感H5蛋白，并在BIAcore 3000中运行。将VHH调整浓度到 12.5–250 nM， 在没有H5的对照流道中运行，并以30 ml/min的流速平行运行在H5耦合流道中。再用1mM NaOH对芯片进行再生。
② 对VHH和RSV FTM-的亲和力进行检测， 用BIAcore T1000进行检测。
CM5芯片上通过胺偶联 400RU的 稀释在pH 4.5的10M醋酸钠中的RSV F蛋白，并在BIAcore 3000中运行。
将VHH调整浓度到1-243nM，0.5–500 nM的Synagis Mab 在对照流道中运行，并以45 ml/min的流速平行运行在F蛋白的耦合流道中。再用100mM的盐酸用于芯片再生。
通过拟合1:1相互作用模型(Langmuir结合模型)，对缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡解离常数(KD = kon/koff)进行了评价。使用Biacore T100软件v1.1进行RSV评估，使用Biacore 3000软件v4.1进行H5流感评估，从参考流通道中去除背景。

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RSV  VHH的中和活性和交叉保护活性
通过结合性ELISA和竞争性ELISA对筛选到的VHH鉴定，挑选12株和SV Long毒株(A型)进行微中和活性。
其中两株RSV-D3和RSV-C4，能中和RSV Long毒株。
RSV-D3和毒株之间的亲和力IC50为250 nM (Fig. 1A). RSV-D3 and RSV-C4 VHH和RSV B1(B型) 之间没有中和活性。RSV-E4和RSV Long毒株之间有轻微的结合活性。
ELISA竞争实验使用两个中和单抗，Synagis (人源化的鼠单抗Mab 1129, 识别表位II) 以及101F(识别表位IV–VI)，结合F蛋白的不同表位，VHHs RSV-D3和SV-C4纳米抗体和Synagis Fab之间有竞争性。RSV-E4和101F Fab之间有竞争性结合表位。
高浓度的RSV-D3和RSV-C4也和101F Fab之间有竞争性关系，说明这两个纳米抗体主要识别表位II，但是其他表位也存在一定的重叠。

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进一步用ELISA分析这些纳米抗体是否和RSV逃逸株产生反应。
VHH RSV-D3和RSV-C4对于位点II突变的病毒株反应敏感，证实了两株抗体和Synagis之间存在竞争性表位。
VHH RSV-E4 对于位点IV–VI突变的病毒株反应敏感, 证实了和101F之间存在表位竞争关系。
RSV-C4和RSV-D3在和变异株结合时有轻微的区别，可能和两个抗体的亲和力和识别不同的重叠表位有关。
RSV-D3和RRA3之间存在很弱的结合力，RRA3是一个在表位II和表位IV–VI有突变的变异株。
SPR检测证实了单价纳米抗体有很强的亲和力。
其中VHH RSV-E4和RSV F蛋白之间的亲和力为0.45 nM，Mab Synagis的亲和力0.64 nM。

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对双价RSV-D3的纳米抗体进行鉴定，是否能提高纳米抗体和病毒之间的中和活性。双价的RSV-D3和单价的RSV-D3纳米抗体相比较， 和RSV Long病毒株亲和力提高了4000倍。
三种双价的RSV-D3抗体的IC约为0.1nM， 都比Synagis Mab（6.5 nM）和Synagis Fab（1.3 μM）的IC50高。
三种不同linker (15, 25，35 GS )的双抗之间没有太大的差异。

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构建VHH RSV-D3/E4双特异性抗体，linker长度分别设为9，15，25。能识别F蛋白的不同表位， RSV Long strain and RSV B1 strain.
The two biparatopic VHHs, RSV-D3/E4 VHH having linkers of either 9 or 15 residues, had comparable neutralization potency as the Synagis Mab (IC50 of 6.5 nM) and were about 40-fold better in neutralizing the Long strain (subtype A) and RSV-D3/E4(9GS) was more than 500-fold better for the B1 strain as compared to the monovalent VHHs. There was no significant difference in neutralization potency of the RSV Long strain between the two biparatopic VHHs RSV-D3/E4(9GS) and RSV-D3/E4(15GS) (IC50 of 6 nM and 5.2 nM, respectively) (Table 2).
linker为25的双抗和RSV Long病毒株之间的IC50为18nM ，比linker为9或者15的双抗和RSV Long病毒株之间的IC50要低，由此可见，双价的纳米抗体比双抗和对病毒株的中和活性更强。

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进一步鉴定双价抗体是否和RSV B1病毒株之间有中和活性，以及两个纳米抗体之间的前后顺序对抗体的中和活性是否有影响。RSV-D3在N端-RSV-E4在C端，连接linker是9的双抗（IC50=1.8 nM） 和RSVE4/D3双抗（IC50=29 nM）相比较，和RSV B1之间的中和活性要多高15倍。
RSV-E4 (5 nM) 和RSV-D3 (5 nM)等比例混合联合使用，比 (10 nM)的单价抗体RSV-E4相比较，和病毒株之间的中和活性要高。

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纳米抗体对流感病毒H5N1的保护和中和活性
用A/Vietnam/ 1194/04毒株筛选得到的28个纳米抗体中挑取两个(Infl-C8和Infl-B12),用于中和假病毒A/Vietnam/1203/04 。
两种VHH都与唾液酸糖蛋白胎蛋白竞争，胎蛋白结合血凝素5的受体结合位点(图3B)。oth VHH competed withsialylglycoprotein fetuin, which binds the receptor binding site ofhemagglutinin 5 (Fig. 3B). The VHHs had affinities to hemagglutinin 5 of clade 1, A/Vietnam/1194/04 in the nanomolar range(9.9 nM and 30 nM for Infl-C8 and Infl-B12, respectively)(Table 1). VHHs Infl-C8 and Infl-B12 neutralized A/Vietnam/1194/04 as effectively as A/Vietnam/1203/04. No synergisticeffect was observed when mixing the neutralizing VHH in anequimolar ratio, only an additive effect (data not shown

用MLV(H5)假病毒中和试验评价了VHH对H5A / Vietnam/1203/04 (clade 1)病毒的中和能力。
在上选择28个测试VHHs (inflc - c8和inflc - b12)中的2个，中和了伪型A/Vietnam/1203/04病毒(图3A)。中和是重复进行的，图表表示几何平均值。VHHs与进化支1中的hemagglutinin 5, A/Vietnam/1194/04具有纳米级的亲和力(对inflc - c8和inflc - b12的亲和力分别为9.9 nM和30 nM)(表1)。VHHs inflc - c8和inflc - b12中和A/Vietnam/1194/04的效果与A/Vietnam/1203/04相同。当中和VHH以等摩尔比混合时，没有观察到协同效应，只有加性效应(数据未显示)