High-throughput isolation of immunoglobulin genes from single human B cells

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构建Ig线性表达框：
扩增三组PCR产物，每组产物的读码框包括以下片段：
1.) C片段：包括CMV启动子(705 bp)，Ig 信号肽序列 (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)
2.) H片段(1,188 bp)包括IgG1的重链恒定区(315 aa)和 BGH poly(A)信号肽序列； K 片段 (569 bp)包括k链恒定区(107 aa)，BGH poly(A)信号肽序列； L片段 (552 bp) 包括λ恒定区 (102 aa)和 BGH poly(A)信号肽序列
3.) 线性Ig表达框在5‘和3'端分别是Nhe I和Xba I酶切位点，便于插入到真核表达载体中。

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C, H, K ,L 四个片段插入到pCR2.1质粒载体中，构建得到HV0024, HV0023,HV0025，HV0026。扩增，反应体系为50ul。
1单位AccuPrime pfx聚合酶, 5 μl的10× AccuPrime PCR缓冲液,1ng质粒, 10 pmol引物对。
全长线性表达框通过3片段融合而得。
PCR体系为50 μl：1单位的KOD DNA聚合酶 (Novagen,Gibbstown, NJ), 5 μl 聚合酶缓冲液，10× PCR缓冲液, 200 μM dNTP, 10 pmol引物对 CMV-F262 和BGH-R1235，3片段含量各1ng。
PCR反应条件为：98°C作用1 min, 98°C  15秒，60°C 5秒，72℃ 35秒，一共25个循环，最后再72℃延伸10min。

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重组抗体的表达
成对的PCR反应产物（1个重链+一个K链，或者一个重链+一个λ链）共转染融合度为80-90%的293T细胞，12孔板中的细胞，每孔转染1μg，质粒HV13221和HV13501 (1μg/孔) 作为阳性对照，转染后6-8小时，更换培养基，37℃继续孵育72小时。

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检测转染细胞的上清中重组单抗浓度:

在96孔板中加入鼠抗人的Ig，每孔200ng，4℃包被过夜。
封闭液用4%的溶于PBS中乳清蛋白, 15%山羊血清，0.5%吐温-20，0.05%叠氮钠。
每孔加100 μL上清，室温下孵育2小时。
加AP标记的山羊抗人IgG(1:3000稀释) ，室温下孵育1小时，显色 。
用于检测抗-HIV-1抗体的抗原包括：
HIV-1 Env MPER多肽, SP62 (QQEKNEQELLELDKWASLWN)
HIV-1 Env 免疫显性表位 SP400(RVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLNKI)
SP62-乱序重排肽表位作为阴性对照 (NKEQDQAEESLQLWEKLNWL)
HIV-1 gp41和HIV-1 JRFL gp140蛋白
Fluzone® 2007-2008疫苗。三价灭活疫苗，包括 A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1)-like virus, an A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-like virus和a B/Malaysia/2506/2004-like virus,
流感不同成分的抗原

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单抗mAb 2F5 VH 和 VL基因钓取出来后插入到pcDNA3.1/hygro质粒中，建立稳转细胞系。细胞上清中收集的2F5抗体和商品化抗体用于比较和假HIV-1病毒的中和活性。

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以2F5抗体为阳性对照，PCR扩增出的条带：
1，片段C (705 bp)；2，H片段 (1,188 bp)；3，K片段 (569 bp)；4，2F5VH 片段(489 bp)5，2F5 VL片段 (370 bp)；6、线性Ig重链片段 (2,339 bp) 7、线性Ig轻链片段 (1,595 bp)

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流式分选可利用淋巴细胞的表面标志物，如：CD3、CD19、CD20、CD27、CD38。其中CD3是T淋巴细胞表面标志分子，CD19是B淋巴细胞表面标志分子，表达于B系细胞及滤泡树突状细胞上，在B细胞的整个分化阶段，或高或低都有表达，CD20是成熟B淋巴细胞表面分子，是B细胞的分化阶段标志物，在原始B淋巴细胞期并不表达，CD27和CD38则是抗体分泌细胞表面标志分子。CD235a(血型糖蛋白 A)抗原是一种单跨膜糖蛋白,表达于成熟红细胞和红系前体细胞。

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WB鉴定2F2表达
商品化2F5 (lane 1), 共转染2F2轻重链真核表达载体对到293T细胞后的上清液(lane 2）,共转染2F2轻重链线性表达框对到293T细胞后的上清液(lanes 3)、空白对照293T cells (lane 4).

得到的抗体不仅有全抗（轻重链之比为2：2，150kda)，还有一些重链单链分子(50kDa)，轻链单链单聚体(23kDa),双聚体(46kDa)，三聚体(69kDa)，还有(1:1或者2:1比例)的轻重链组合。

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分别转染2F5的重链轻链真核表达载体，轻重链的线性化的表达框，各1ug。
表达量为1.9 μg/ml IgG + 0.7 μg/ml (mean ± SEM）和1.7 μg/ml + 0.4 μg/ml

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ELISA鉴定2F5抗体的结合能力：
和预期一致，线性化的读码框或者是双质粒转染后的细胞上清，和商品化的2F5抗体一致，和HIV来源的多肽结合，而和阴性对照不结合。