纳米抗体 2022 综述

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纳米抗体的CDR区和非CDR区可视图:VHH A.20 (PDB 4NBX; 大约为2.5 × 4 × 3 nm大小)

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对227个常规抗体-抗原复合物进行结构分析发现，80%的相互作用局限于4-13个残基。此外，在30个和亲和力结合有关的热点位置中，有3个位于框架区，另外27个位于CDR区，说明传统抗体比重链抗体更加依赖于CDR区和抗原结合。
综上所述，说明VHH-抗原相互作用不同于传统抗体-抗原相互作用，更类似于蛋白质-蛋白质之间的相互作用。

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我们认为， VL 结构域的缺失使 VHH 成为一种新的抗原结合结构域，其中CDR区的传统作用有所改变，非CDR区也发挥结合活性的功能。此外，一些进化机制增加了 VHH 库的多样性，如CDR1 和 CDR3 环中增加了氨基酸的长度和复杂性，非 CDR区域中参与抗原结合的FR2 和“ CDR4” 区(残基 76-80，Kabat 编号)，同时还影响到CDR3区构象，并增加了体细胞高突变率。由此可见，VHH骨架上的每一个氨基酸位置对于纳米抗体结构完整性和抗原结合能力都非常重要。

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骆驼源重链抗体的遗传起源：
对驼类重链抗体库进行基因组序列研究，cDNA测序，二代测序，发现重链抗体在骆驼的适应性免疫系统中发挥独特的功能，经过精确的分子进化机制而得，对重链抗体基因的重要发现有:
① 重链抗体中的第一个恒定结构域(CH1)被剪接掉，VHH 外显子直接和不同长度的铰链区(0-27 aa)进行直接链接;
② 在骆驼重链抗体FR2区，在几个特定的氨基酸位点发生改变，如VHH区类似于传统抗体VH区接触VL的位点：V37F/Y、G44E、L45R 和 W47G (V42F、 G49E、L50R、W52G)，再如 FR1和FR3中，在传统抗体中是和CH1区结合域接触的位点(如 L11S、P14A和A83P)，也发生位点改变；
③ 重链抗体中CDR 区变长，如， VHH的CDR3 长度为3-28aa，其他物种如人类、小鼠和兔子的传统抗体VH区CDR3长2-19 aa。

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免疫遗传学研究表明，骆驼重链抗体存在独特的进化机制，使VHH抗体表位库多样化：
① V-D-J 连接处有很高的插入/缺失率，VHH，DH和JH基因进行重组，形成相对较大的 VHH 基因片段库
② FR3 区重组信号序列(RSS)高频出现(残基 76-78)，有利于支持重组激活基因(RAG)蛋白介导的基因替换;
③ CDR区具有很高的体细胞突变率，包括CDR1 中的一个热点超突变密码子(TAY)，突变进一步扩展到非CDR区域，比如FR3区;
④ 在 FR2 和CDR区存在额外的半胱氨酸残基形成二硫键;
⑤ FR2 区参与抗原相互作用以及协助形成CDR3 环。
    总的来说，免疫遗传学和结构学数据支持这样一种观点，即进化机制积极参与了 VHH 库的多样化，并且与经典 VHs 相比，VHH的非CDR区也参与VHH-抗原之间的相互结合，因此弥补了VL结构域的缺失。

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关于重链抗体的进化原理，比较认可的假设是，这类重链抗体的存在是由传统单克隆抗体通过进化优势而得。VHH独特的抗体表位结构更小，形状更为狭长，可能有效地和一些隐性抗原表位进行结合(例如，酶催化中心或病毒腔隙结构)。事实上，在现有文献报道中，作为酶抑制剂或病毒中和剂的VHHs数量的确远超过传统抗体的类似报道。
VHHs能很好地识别不同病毒株之间高度保守的表位(如，筛选得到针对抗流感A株和B株有交叉反应的 VHHs )；VHHs域内形成的二硫键增加了长 CDR3 环和整个VHHs结构的稳定性，这使得重链抗体能够更好地耐受恶劣的环境条件。   

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大量的基因测序数据发现驼类传统抗体和重链抗体可变区(VH 和 VHH)均由IgV基因编码，两者由互不相同又存在混合的微基因片段进行重组。VH和VHHs分别和相同的IGD以及IGHJ基因进行重排，生成V-D-J基因片段，用于VH和VHH基因片段的转录，骆驼科动物存在类似的VH和VHH基因结构，羊驼大概存在17个VHH微基因，骆驼则存在有42个VHH微基因。

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对羊驼基因组和 cDNA 序列的同源性分析表明，IgH基因座上至少存在 3个V亚群：
① IGHV1(与人类IGHV族II中的VH家族 2、4、6 同源);
② IGHV2(与人类IGHV族II中的VH家族1，5，7同源）；
③ IGHV3(与人类的IGHV族III中的VH3 家族同源)。
    从小羊驼体内鉴定的所有VHH 基因均与人类IGVH3 同源，并根据序列相似性可分为 6 个亚群。根据大羊驼的cDNA 序列分析，VHH 序列可以分为4个亚群，每个亚群都能展示出VHH 的一个或多个独特特征，例如CDR3区变长，额外的二硫键等。骆驼的VHHs也是和人类IGHV族III中的VH3 家族序列匹配度最高。

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此外，对大羊驼Ig库的cDNA序列进行分析，鉴定出一组有前导序列的VH基因，和人类IGHV族II中的VH4家族高度同源。这些VH基因在FR2中没有促溶作用的标志性氨基酸改变，VDJ进行重排可以编码传统抗体或者重链抗体。这段基因和人VH4基因有高达79-89%的同源性，因此这些驼类抗体可以绕过人源化直接用于人类。如，通过噬菌体展示技术筛选免疫羊驼文库，得到和树突状细胞上的CD11c+具有结合特异性的 VH4 结构域。

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   驼类抗体的恒定区由三个不同的基因进行编码：IGHG1编码传统抗体IgG1的CH1区，IGHG2和IGHG3分别编码重链抗体IgG2和IgG3。重链抗体编码基因在CH1-铰链区内含子的5’端发生G-A的突变，破坏了IGHG1基因中的剪切位点，从而在mRNA剪切过程中导致CH1区的缺失。
    在大小羊驼体内，还发现有IGHG1A、IGHG1B、IGHG2A、IGHG2B、IGHG2C和IGHG3等基因，其中 小羊驼IGHG2B和IGHG2C基因中缺乏 CH1区。