A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

青龙偃月刀

37 °C摇床 , 170 -200 rpm
96孔免疫板 (Nunc, cat. no. 439454)
8通道排枪 30-300 μl (Thermo Scientific, cat. no. 4662030), 5-50 μl (Thermo Scientific, cat. no. 4662010)
Nunc 微孔板密封胶带 236366 (Thermo Scientific, cat. no. 10170671)
PCR8联排 (8-tube strips, Greiner bio-one, cat. no.673210; cap strips, Greiner bio-one, cat. no.373270)
无RNase离心管 (Eppendorf, cat no. 0030 121.589)
长颈振荡培养瓶(1 liter, 250 ml) (Sigma-Aldrich, cat. no. F0769, F0644)
ELISA 读数仪
滤膜：0.22 μM and 0.45 μM (Sarstedt , cat. no.83-1826-001, cat. no.83-1826)
Uni-SepMAXI+淋巴细胞分离管(Gentaur, cat. No. NVU16)

青龙偃月刀

所需试剂：
20% 葡萄糖：100 ml水中溶解20g葡萄糖，高压灭菌，常温下可保存数月。
20% PEG6000/2.5M NaCl：200 g  PEG6000和146.1 g NaCl充分溶解在水中，定容至1L，高压灭菌，常温下可以保存数月。
2 × TY培养基：1L水中溶解16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl ，在4°C 能保存半年，常温下保存1个月。ABTS：在500ml的50mM柠檬酸钠（pH 4.0）.中溶解 0.11 g ABTS，0.2 μm过滤，4 °C保存，每次使用前每10ml溶液加入10ul双氧水。
AEBSF 保存液：(4 mg/ml) 1ml的PBS中溶解4mgAEBSF，可在−20 °C长期保存。注意：强的丝氨酸蛋白酶抑制剂，操作时避免接触和吸入。
抗生素-青霉素(100 mg/ml)：在10ml水中溶解1 g氨苄青霉素，0.22uM过滤，分装后保存。

青龙偃月刀

封闭液： 1 g 脱脂奶粉加入到50ml的靶蛋白合适的液体中，充分溶解，新鲜配置。
氯仿/异戊醇：24体积的氯仿加1体积的异戊醇，4°C长期保存。包被液：8.413 g碳酸氢钠，溶解于1L纯净水中，用1M Hcl调节pH到8.2，4°C可保存数月。
DNPP试剂： 1L水中溶解12.1 g Tris, 1.02 g 氯化镁，5.84 g NaCl 用 1 M HCl 调节pH至9.5，高压灭菌， 4°C可保存数月。使用时，调整浓度至2mg/ml，新鲜配置。
IPTG保存液 (1M) ： 溶解1.19 gIPTG到5ml水中， 0.22 μM滤器过滤，−20 °C 可保存至少1年。
LB 培养基：常温下保存。
10 × M9 培养基：1L水中加入 60 g Na2HPO4.H2O, 30 g KH2PO4, 5 g NaCl 和10 g NH4Cl ，调整pH至7.4，高压灭菌，常温下保存数月。
抗生素-卡那霉素(25 mg/ml) :溶解0.25 g卡那霉素至10ml水中，0.22uM滤器过滤，分装冻存，−20 °C 可保存至少1年。
M9基础培养基平皿：20ml的10 × M9培养基，加入180ml温热的2%琼脂粉溶液，加入无菌试剂， 200 μl 的0.1 M CaCl2, 400 μl的1 M MgSO4.7H2O, 2 ml 的20%葡萄糖, 1 ml的 1 mg/ml硫铵素盐酸盐，4°C可保存至少1个月。
中性抗生物素蛋白储存液：(1 mg/ml) :10ml的PBS中溶解10 mg的中性抗生物素蛋白，分装后冻存。 −20 °C可放置数月。
PBL裂解液：50ml的无RNase水中加入 23.6 g硫氰酸胍 , 0.37 g柠檬酸，0.25 g月桂酰肌氨酸，调整pH到7.0，在−20 °C下可保存数月。
PBS(10 ×) ：在1L水中溶解2.4 g KH2PO4, 14.1 g Na2HPO4.H2O, 2 g KCl 和80 g NaCl，稀释成1 × PBS时ph到7.4，常温下可保存数月。

青龙偃月刀

PBST：1 × PBS 溶液1L，加入 500 μl Tween-20，常温下可保存数月。
2M醋酸钠 ( pH 4.0)：100ml水中加入27.2 g醋酸钠.3H2O，调节pH 为4.0，常温下可保存数月。TB培养液：1L水中溶解12 g胰蛋白胨，2.3 g KH2PO4, 12.5 g K2HPO4, 24 g 酵母提取物和2.5 m甘油，高压灭菌，4°C可放置半年，常温下放1个月。
TES缓冲液：1L水中溶解24.22 g Tris, 0.19 g EDTA和171.15g 葡萄糖，pH值调节到8，4°C可长期放置。
TES/4 ：250 ml TES缓冲液加750 ml 水， 4°C可保存数月.
5×TBE缓冲液：800 ml水中溶解 54 g Tris盐和27.5 g 硼酸，加20 ml 0.5 M EDTA，补水定容至1L，用于电泳时需要稀释5倍。
胰酶储存液(pH 8.0) ：100ml PBS中溶解1g胰酶，分装后保存。

青龙偃月刀

实验流程
蛋白保存和分析  耗时1天

整个实验流程需要1mg的蛋白，其中700ug用于免疫骆驼，剩余蛋白用于纳米抗体的筛选，鉴定和表征工作。

1. 取1mg蛋白样品进行分装，先取700ug分装到7管中，100ug/管。剩余的蛋白分装到若干个PCR管中，10-20ug/管，速冻，避免反复冻融，长期保存需要放-80°C。
2. 分装10管5ml的蛋白保存液。

3. 使用时从低温环境中取出冻存蛋白，在手中快速融化蛋白液，用定量功能实验或者生物物理分析实验确定蛋白为正确折叠。

青龙偃月刀

骆驼免疫 耗时6周：
4. 常规情况下，用5种不同的靶抗原蛋白混合后免疫骆驼，如果蛋白之间不能混合，则将每种蛋白分开免疫，多点皮下注射淋巴管附近的不同部位。免疫时需要对蛋白样品进行低温操作，首次免疫，各蛋白用量为200ug，一共1ug。后续免疫，每种蛋白用量为100ug。免疫样品体积控制在300-1000ul，确保蛋白安全，不能致动物死亡。5，首次免疫前，取4ml的血，加入非抗凝管中，室温下静置2小时后分离血清，-20℃冻存备用。
6  免疫六次，每次间隔1周，在1，2，3，5次免疫时，将免疫原和等体积的GERBU佐剂混合乳化，体积最大不超过2ml，在骆驼颈部靠近淋巴管处，皮下多点注射免疫，为了减少佐剂对免疫原空间构象的影响，建议在第4次和第6次免疫时，在蛋白样品中不加佐剂，而是将蛋白直接注射免疫骆驼，然后在距离进针处5cm的位置，再单独注射佐剂，加强免疫。

青龙偃月刀

血样采集和淋巴细胞制备 耗时1天
7. 末次免疫后3-5天，从颈静脉取血100ml，收集到EDTA-抗凝管中，上下颠倒2次防止凝血，尽快运输到实验室中进行处理。注：凝血会影响淋巴细胞总RNA的提取。
8. 将尚未稀释的血液平均分配到4个Uni-SepMAXI+试管中，分离外周血淋巴细胞（PBLs）。PBLs位于血浆和细胞分离液之间，分装到4个50毫升Falcon试管中。回收上层含IgG的血浆，用于第11步，测定血清抗体阳转率。血浆样品可在−20°C下保存数年，不会出现明显的活性损失。
9. 用PBS液10倍稀释PBLs，4℃，800g离心20分钟。
10. 小心弃上清，用至少5ml的PBS重悬细胞，收集到50ml的离心管中，等分到至少2个50ml离心管中。4℃，800g离心20min。弃上清，倒扣在纸巾上充分去除残余液体，每个细胞团大约含有5×10^8个PBLs。可以立刻取合适的量用于RNA的提取，剩余的细胞保存在-80 °C，至少可以存放6个月。

青龙偃月刀

分析血清阳转率 耗时2天
11. ELISA检测免疫前和免疫后的骆驼血浆中抗体滴度，针对每个抗原血清阳转率情况。
12. (可选）对重链抗体进行单独的滴度检测。

青龙偃月刀

提取RNA 耗时1天
进行RNA操作时，需要戴手套和使用无RNase的材料和试剂。
13. 在5×10^8个PBLs细胞中加入4ml的PBLs液裂解细胞，用19G和23G的针头进行反复抽吸破坏DNA，将澄清的液体加入到15ml的离心管中。
14. 加入400ul的2M醋酸钠(pH 4.0)，4ml饱和酚，2ml的24:1(氯仿:异戊醇)溶液，充分混匀后，冰上孵育10min，4℃，3200g离心10min。
15. 将上层水相转移到15ml离心管中，避免接触中间层，加4ml饱和酚，2ml的24:1(氯仿:异戊醇)溶液，充分混匀后，冰上孵育10min，4℃，3200g离心10min。
16. 将上层水相(约3ml)转移到15ml离心管中，避免接触中间层，等分到6个无RNase的离心管中，每管加500ul的冰乙醇，充分混匀后，-80℃放置至少30min沉降核酸。
17. 4℃，20000g离心20min，弃上清，室温下吹干残留液体，加20ul的无RNase水进行充分溶解。
18. 定量，通常50ml的血液能获得100-250ug的RNA。
备注：如果需要长期保存RNA，可以在RNA液体中加入0.5倍体积的2M醋酸钠（pH 4.0）和2.5倍体积的无水乙醇，-80℃至少可以保存一年不降解。

青龙偃月刀

cDNA合成  耗时4小时
19. 用50ul的无RNase水稀释50 μg RNA，加2.5ug随机6核苷酸引物，65 °C 孵育7min，冰上放置5min退火。
20. PCR管中依次加入以下物质， 20 μl的5x SSII反转录酶缓冲液，10 μL的100 mM DTT, 2 μl的dNTPs (25 mM), 2 μl的RNase out, 2.5 μl的SSII反转录酶， 12.5 μl 无RNAse水，25 °C孵育10min，42 °C孵育2小时， 72 °C孵育15min。
备注： cDNA保存在-80°C，可以存放数年。