关于纳米抗体的读文献笔记

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纳米抗体的筛选方法--哺乳细胞展示
是利用细胞表面膜蛋白，宿主细胞为CHO、293等工程细胞，其蛋白质的折叠、分泌以及翻译后修饰等过程与人体最为相似，因此在全长抗体蛋白方面的展示有一定的潜力，但是抗体库构建效率低，库容小。　　

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纳米抗体的应用范围：
Nb 具有许多独特的性质，包括高亲和力和高特异性，组织穿透能力强、生产成本低、折叠能力强、易于结合蛋白裂隙表位以及在极端条件下稳定性高等优点。免疫原性和毒性非常低， 很适合进行基因改造, 且不像SCFV那样容易粘连，在肿瘤治疗与诊断、病毒检测与治疗、传染病治疗、食品安全检测等领域展现了广阔的应用前景。

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纳米抗体的应用--在亲和纯化方面的应用
纳米抗体具有非常稳定的理化性质和生物活性，可以经过反复变性，复性而不降低与抗原结合的能力。纳米抗体由于易表达，生产成本低，稳定性好，可以作为亲和色谱配基来实现特异性蛋白和一些小分子的亲和纯化。
Verheesen 等首次报道了利用VHH 建立亲和层析柱，用于纯化抗凝蛋白ISP。他们针对一种抗凝蛋白ISP来筛选特异性的纳米抗体，然后用纳米抗体建立亲和柱，用来纯化ISP蛋白，重复使用多次，纳米抗体仍然没有丧失与抗原的结合活性。Klooster 等利用HSA 和IgG 特异性VHH 成功分离了血液中的HSA和IgG，而且相较于传统的Protein A 亲和柱，anti-IgG VHH 大大减少了IgG 的损失。
另外，Franco 等也证明了VHH 有效分离小分子物质咖啡因、茶碱等化学物质。

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纳米抗体的应用--纳米抗体用作细胞内抗体
细胞内部处于还原性环境，不利于蛋白二硫键的形成，因此一般抗体在细胞内不能稳定存在。
VHH抗体不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，已被证实能正确的靶向亚细胞组分，比反义实验更能有效的抑制靶标功能。
另外，VHH抗体通常比scFv更稳定，甚至在细胞质的还原环境中也能维持较高的抗原结合能力，因此纳米抗体为细胞内抗体的研发开拓了思路。
Alzogaray等利用噬菌体展示技术从免疫的驼源纳米抗体库中筛选得到特异性结合细胞毒素SpvB的抗体，有效抑制了SpvB引起的细胞毒性信号通路。低氧诱导因子HIF-1α主要位于胞质中，部分胞核中也有表达，只有采用胞内抗体技术方可有效抑制其蛋白活性。

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大分子单抗缺点：
组织（如实体瘤）穿透能力差、生产和储存成本高、价格昂贵，促使研究人员对抗体分子进行基因工程改造，如小型化（Fab、ScFv 以及Nanobody）或发展基于新的结构骨架的抗体类似物或模拟物。
大分子抗体的导向疗法尚存在着较大的困难：
(1) 抗体在机体免疫原性大：鼠源抗体，常会诱导人抗鼠抗体的免疫应答；
(2) 难以获得所需特异性的免疫球蛋白的特定亚类：完整的大分子抗体不一定能到达作用部位．抗体恒定区的其他功能会引起一些不良反应；
(3) 人的杂交瘤制备较为困难．直接用人的单克隆抗体治疗疾病尚难开展。

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纳米抗体的应用--用于食品检测与治疗
国内学者冯凡等筛选出黄曲霉毒素B1（AFB1）抗抗体F7，F7 既是AFB1的抗抗体，也兼具有纳米抗体的特性，它能模拟AFB1 引起机体毒理反应的空间构型，但不具有毒性，为动物甚至人预防黄曲霉毒素的新一代基因工程疫苗奠定了基础。
Kirchhofer等报道了一种能够调控绿色荧光蛋白(GFP)构象及光谱性质的纳米抗体，该抗体可以通过控制蛋白构象，增强荧光信号来提高食品检测的灵敏度，具有重要的现实意义。食品毒理学研究表明，纳米抗体能够结合细菌，通过改变其代谢途径抑制产酶的活性，从而起到一定的治疗作用。

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纳米抗体的应用--纳米抗体用作肿瘤的诊断
早期快速诊断与监测，是抗肿瘤研究的一个主要难题。
理想的显影剂应该很容易渗入到目标组织中，并能够在其他的非特异性抗原干扰之下与靶抗原高亲和力结合，没有结合的显影剂能快速被清除。
单抗显影剂分子大，组织穿透力差，不易被清除，容易产生HAMA。在稳定性，亲和力和表达方面上存在缺陷，且容易聚集在坏死区域。
纳米抗体具有高度的靶向性和特异性，Nb 的细小使它具有极强的穿透力, 能穿过血管进入组织, 没有和相应抗原结合的纳米抗体能够快速清除，可更好地应用于显像和治疗，连接各种显影物质用于癌症和感染性疾病的诊断。
通过改变造影剂外壳的组成成分，或在外壳上连接针对组织特异性抗原的抗体或特异受体的配体, 可构建针对特定组织的靶向超声造影剂。

单克隆抗体的渗透性差，不易清除，而纳米抗体与靶结合位点具有较高的亲合力和良好的组织渗透性，在肿瘤检测与诊断方面有很大的优势。
Nb 可连接各种显影物质用于疾病诊断。Nb 具有高度的靶向性和特异性, 通过改变造影剂外壳的组成成分,或在外壳上连接针对组织特异性抗原的抗体或特异受体的配体, 可构建针对特定组织的靶向超声造影剂。
将半衰期短的放射性核素如99mTc和68Ga标记纳米抗体后可进行肿瘤成像。
Nb 的细小使它具有极强的穿透力, 能穿过血管进入组织, 可更好地应用于显像和治疗。连接绿色荧光蛋白( GFP) 和V H H 形成复合物, 这种复合物能靶向地结合到活细胞, 可用于疾病的诊断。
Huang等将99mTc标记anti-EGFR（epidermal growth factor receptor）纳米抗体（8B6)用于体内检测EGFR的表达。正常小鼠体
内生物分布显示，该抗体主要经肾排泄，半衰期约1.5h，并且SPECT显像显示其在EGFR高表达和低表达的肿瘤之间有明显的差异。
前列腺癌的早期检测是基于血液中的前列腺特异性抗原(PSA)的检测，但是血液中不同亚型的PSA会干扰检用于疾病诊断。Saerens等获得的PSA纳米抗体能区别不同亚型的PSA，可用于诊断不同阶段的前列腺癌。

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融合具有治疗作用的结构：　
酶是生物体内强大的催化剂, 将某些酶同Nb 结合可用于疾病的治疗。
将β内酰胺酶和识别肿瘤标记物的VHH融合在一起, 制成抗体依赖的酶前体药物。
VHH 和肿瘤特异结合, 在肿瘤区域大量聚集, 通过小鼠静脉给药的药物前体在内酰胺酶的作用下会变成高毒性的分子, 结果在肿瘤周围的部位产生了高浓度的毒性物质。
通过这种抗体依赖酶前体药物治疗方法, 能够完全消除小鼠模型中已形成的实体肿瘤,并不再复发。
将葡萄糖氧化酶的和抗变形链球菌VHH 融合在一起, 低浓度的融合蛋白在有乳酸过氧化物酶和碘化钾的存在时, 能在20 min内选择性地杀死变形链球菌

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在癌症治疗中，纳米抗体主要有以三种形式广泛存在：1.直接靶向肿瘤靶标
的特异性纳米抗体 2.与其它效应分子形成免疫融合物3.靶向输送药物的导弹头。
抗体库技术实现了纳米抗体能够结合任何靶标位点（信号通路中的配基或受
体）的可能性。HGF（肝细胞生长因子）是一种分泌蛋白，在肿瘤细胞中过表达
可促进肿瘤血管生成，抑制其凋亡。Vosjan等[51]制备了制备了1E2-Alb8、
6E10-Alb8两种anti-HGF纳米抗体，同时偶联了白蛋白的纳米抗体以延长半衰期。
实验结果显示，6个裸鼠中分别有3（1E2-Alb8）、4(6E10-Alb8）个体内移植的肿
瘤组织完全消除。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor EGFR）
几乎在众多肿瘤中都有高表达。目前靶向EGFR的纳米抗体已有许多文献报道，
包括单价抗体、二价抗体、双特异性抗体等[52-55]。纳米抗体已在许多研究中证实，
是具有潜力的治疗工具。
纳米抗体在肿瘤治疗中，可以作为一种运输效应分子（酶、毒素等）到靶细
胞的一种工具。Cortez-Retamozo等[56]将癌胚抗原(CEA)的纳米抗体与阴沟肠杆菌
B内酰胺酶连接，选择性激活抗癌前体药物，能完全治愈LSl74T肿瘤异种移植物，
而没有任何副作用。纳米抗体融合免疫毒素并将其运载到肿瘤组织，可减少毒性
分子对正常细胞的损伤，并且有效抑制了肿瘤的增长[57]。
在纳米输送系统中，纳米抗体由于其分子特性及高亲和性可呈现其表面，小
分子药物包裹其内部。纳米抗体一方面充当靶向肿瘤的导弹头，一方面也是有效
的抗体药物。多价纳米抗体-脂质体平台首次用于EGFR 的过表达研究，多个纳
米抗体(EGa1)通过识别EGFR 的胞外域，显著降低了A431 人肿瘤细胞表面的
EGFR[58]。随后，该脂质体平台又引入了受体抑制剂AG538，在体外更加有效的
抑制了人头颈癌细胞系14C 的生长[59]。纳米抗体-胶束系统适用于一些疏水性药
物或是难以在血液中运输的药物，如阿霉素DOX[60]。此外，白蛋白聚合纳米颗
粒利用聚乙二醇连接EGa1 纳米抗体，其内部包含多激酶抑制剂17864，形成纳
米抗体- 白蛋白纳米颗粒(nanobody-albumin nanoparticles,NANAPs ）。这种
NANAPs 与14C 癌细胞的结合力是无纳米抗体修饰的40 倍[61]。实验结果证明了
NANAPs 平台作为一种新型的药物输送系统，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。

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疾病治疗
单域抗体和传统抗体一样可以用于疾病的治疗， 但因为单域抗体发展得比较晚， 因此目前用于疾病治疗的单域抗体数量不多，目前仅有一株单域抗体卡普赛珠caplacizumab（ALX-0081）上市，其他多数还处于临床研究阶段。卡普赛珠是一种新型的很有潜力的抗血栓药，它能靶向结合在凝血连锁反应非常早期出现的血管假性血友病因子。
这种双价复合物能在进行止血作用的同时，选择性地阻止血管高剪切力环境中不想要的血栓的形成。

阿兹海默症(Alzheimer's disease，AD)是一组原发性退行性脑变性疾病，又称为老年痴呆症，其病理特征为β-淀粉样多肽(Aβ)的沉积。Kasturirangan 等利用噬菌体展示技术筛选了Aβ 的纳米抗体E1，可以选择性识别Aβ 低聚物，结合其他治疗方法使得E1 具有潜在的应用价值。


TNF-alpha Nanobody®是用于治疗类风湿性关节炎的VHH 纳米抗体药物，也已顺利完成部分临床研究。
纳米抗体作为一种新型抗体，其优越性使其在抗感染、抗炎及消化系统疾病等方面也具有很大的发展前景。