A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

青龙偃月刀

构建免疫库：耗时5天
21 扩增抗体VH和VHH区，引物用CALL001和CALL002特异性引物，PCR反应体系如下：
1ul cDNA，5ul 10×Kapa Taq缓冲液A，10uM的上下游引物各2ul，1ul 10mM dNTP，1ul 聚合酶，补水至50ul。
反应条件
95℃ 3min 一轮，94℃，1min，57℃，1min，72℃ 45s，2-31轮，每轮延申时间加1.2s，72℃，7min。
备注：PCR建议可以平行设置多管，cDNA模板分别取0，0.5，1，2，4ul。
22 PCR结束后用1%凝胶跑DNA电泳，理论上可以得到两条带，分别为VHH链，约700bp，以及传统抗体VH链，约1000bp，选择能精准分离700-1000bp条带的反应管条件为最优条件，用八联排的管子重复PCR放大扩增体系。

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23 电泳跑胶后，分离纯化700bp的条带，定量。

24 以700bp条带作为模板，用VHH-Back/VHH-for引物，巢氏PCR进行二轮扩增。

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25 PCR产物进行回收纯化
26 取10 μg 的噬菌粒pMES4或pMESy4 ，用PstI, Eco91I和XbaI进行酶切，酶切体系设为250 μl。同时取3ugPCR产物用PstI, Eco91I进行酶切，酶切体系设为100ul，酶切后产物用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。
注：回收的酶切产物可以在-20℃冻存，保存至少六个月。
27 将100ng的酶切后载体和30ng的PCR产物进行连接，常温下连接2小时，对连接体系进行优化，转化效率至少达到10^7个/100ng
28 用QIAquick PCR纯化试剂盒对连接产物进行纯化，取5ul加入到25ul电转细胞TG1中，进行电转。
29 用LB液对电转化细菌进行10倍稀释，分别取 100μL的1/10,000, 1/1,000 和1/100稀释的菌液，涂布含2%葡萄糖的Amp抗性的平皿，37℃孵箱进行培养。

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30. 第二天取出平皿，计数长出的单克隆，计算电转转化效率，挑选20个单克隆，在50ul水中重悬，进行菌落PCR鉴定。分析PCR产物大小，确保75%的转化子中含有正确的纳米抗体基因。
备注：如果100ng的载体构建的连接产物产生低于5×10^5或者低于75%的转化子含有正确的纳米抗体序列，需要重复第26-30步的实验。
31. 制备充足的连接产物，确保能产生10^7的转化子，16℃连接。
32. 用QIAquick PCR纯化试剂盒对连接产物进行纯化，用30ul的EB缓冲液进行洗脱。

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33. 将连接产物和TG1电转菌混匀后分装到5个电击杯中，每个反应为25ul的TG1电转菌中加6ul的连接产物，电击后加1ml预热(37℃)的培养基，转移到50ml离心管中，37℃，170rpm×1小时，补加7mlLB液。

34. 取100ul菌液，10倍稀释设置几个梯度(如29步)，涂板，计算库容量，分析阳性克隆率。
35. 将剩余菌液涂布4个245mm的2-YT-GA大方平皿中，37℃培养过夜。

36. 100ml的骆驼血液中通常重链抗体序列的多样性有10^7种，因此库容量达到10^7，即可满足以下实验需要，用4ml的LB培养基加入到方形平皿中，刮下细菌后，收集到50ml离心管中，每个平皿再用2ml的LB培养基冲洗，收集菌液到同一个离心管中，加入20%甘油，充分混匀。测OD值，分装成若干管，200ul/管，-80℃冻存，可存放数年不影响活性。

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免疫库的呈现和扩增 耗时2天
37 第一天，取6OD的免疫库加入到60ml的2-YT-GA培养基中，对于一个库容量是10^7的免疫库来讲，6OD的菌液量覆盖了480个免疫库的多样性，37℃，200rpm摇至对数期（OD≈0.5)。
38 取10ml对数生长期的细菌加入到50ml离心管中，按照MOI=10的量加入4×10^10pfu的VSCM13噬菌体，混匀后，37℃静置30min。

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39 收菌，常温下2800g离心10分钟，弃去上清，吸干残余液体，用40ml的2-YT-KA培养基将菌团重悬，37℃，200rpm，培养菌液。
40 第二天，将菌液转移到50ml离心管中，4℃，3200g离心15min。41 将上清转移到50ml离心管中，加入10ml的20%PEG6000/2.5M Nacl，混匀，上下翻转至少5次，冰上放置至少30min。
42 4℃，3200g离心10min，弃去上清，去除残余液体。
43 用1ml冰预冷的PBS重悬噬菌体沉淀，转移到1.5ml离心管中，20000g离心1min，4℃去除细菌残渣；
44 小心将上清转移到一个新的离心管中，加入250 μl的20%PEG6000/2.5M Nacl，混匀，上下翻转至少5次，冰上放置至少10min。
45 4℃，20000g离心15min，弃去上清，用1ml冰预冷的PBS重悬噬菌体沉淀，转移到1.5ml离心管中，20000g离心1min，4℃去除细菌残渣，转移上清至一新的1.5ml离心管中。

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抗原递呈&噬菌体筛选。 每一轮筛选耗时3天左右
46 第一天: 准备阶段，100ml培养瓶中加入15ml的LB溶液，挑TG1单克隆接种到培养基中，37℃，170rpm震摇至OD600nm=0.5-0.6，冰上放置。
47  对第45步中的噬菌体进行滴度测定。48 TG1细菌特别容易被噬菌体污染，可以取5ul的非感染的TG1细菌滴加到2-YT-GA平皿中，作为阴性对照。
49 96孔板中包被中性抗生物素蛋白，2ng/ul，每孔100ul，4℃封闭过夜，封闭的板子可以在4℃中放置两周而不失去结合活性；
50 第二天：根据第47步实验结果，计算出噬菌体的滴度。 如果滴度低于10^12/ml，重新进行第37-48步的操作。

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实验技巧和困难解决：
51  确保第48步中的TG1没有被噬菌体污染，可肉眼观察在选择培养平皿上，空白菌落是否能够生长。
52 第46步中的TG1细菌100倍稀释到50ml的LB培养基中，37℃孵育，170rpm，直至细菌到指数生长期（OD=0.5-0.6)，冰上放置，待第59、60步使用。53 将第49步中的包被的板子取出，用250ul的PBST清洗3次，加入250ul的封闭液，常温下，在摇床（700rpm）上孵育2小时。
54 对于每个筛选孔/对照孔，提前预封闭10^11cfu的噬菌体+10ul封闭液+100ul合适的筛选缓冲液，分装前可以混合在同一管子里，常温下翻转孵育。
55 用于筛选的靶蛋白生物素标记可以采用Thermo Scientific EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotinylation试剂盒。

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56 固定用于筛选的生物素标记的靶蛋白，移除第53步的封闭液，用250ul的合适的筛选缓冲液进行洗涤。加入饱和剂量的第55步制备的生物素标记的靶蛋白，蛋白溶于10ul封闭液+90ul合适的筛选缓冲液/每孔中，常温，700rpm，摇床上震荡孵育15min，用250ul的筛选缓冲液进行冲洗，重复5次。57  加入第54步预封闭的噬菌体，100ul/孔，常温，700rpm，摇床上震荡孵育2小时。每孔加入250ul筛选缓冲液进行冲洗，去除未能结合的噬菌体，重复15次。每次清洗后，将孔里的液体在纸巾上拍干，不留残余液体，注意防止交叉污染，每次更换纸巾，最后一个洗涤，用枪头将残余的液体吸干。
58 洗脱：每孔加入100ul的0.25mg/ml的胰酶液，常温，700rpm，摇床上震荡孵育30min，胰酶通过蛋白水解作用将噬菌体从固定的抗原上解离下来，将下脱下来的实验孔以及对照孔的噬菌体分别收集在预先装有5ul的4mg/ml的AEBSF溶液中，抑制蛋白酶活性。
59 取50ul噬菌体洗脱液，加入到3ml第52步制备的TG1菌液中，37℃，静置30min，加入7ml的LB-GA培养基，37℃，170rpm孵育培养，取出1ml加入甘油，-80℃冻存。