关于纳米抗体的读文献笔记

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此外，纳米抗体的单域结构特性，使其成为研究抗体结构与功能以及设计新型抗体分子的良好材料。
1）纳米抗体结构简单，可以利用大肠杆菌和酵母进行高效表达。纳米抗体也可以在益生菌如乳酸菌中高效表达，即Lactobody；
2）由于是单域抗体，很容易与其他分子偶联，如连接放射性同位素、连接毒素制备Immunotoxin等；
3）适合作为胞内抗体表达，即Intrabody，可以靶向胞内乃至核内蛋白。Chromobody是一种特殊的胞内抗体，结构为纳米抗体与荧光蛋白融合，从而可以用于监测胞内生化过程。

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2019年2月6日，卡普赛珠单抗（Caplacizumab-yhdp）获FDA批准，联合血浆置换和免疫疗法治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜（TTP）Caplacizumab作为一种抗vWF的人源化、仅包含二价可变结构域的免疫球蛋白片段，能够靶向vWF的A1结构域，防止其与血小板糖蛋白Ib-IX-V受体结合，从而减少vWF介导的血小板粘附和消耗，防止微血管血栓的形成。

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caplacizumab是一株可用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜 （TTP） 的单域抗体， 它的靶标分子是血管性血友病因子， 通过与该因子结合， 抑制该因子和血小板之间的相互作用， 从而防止血小板的聚集[48-49].II期临床的结果显示相比于安慰剂，caplacizumab可以显着的缓解急性发作的TTP,说明了caplacizumab对病人的血小板有保护作用， 但是caplacizumab也同时增加了病人的出血倾向[50-52].ALX-0171是一株针对呼吸道合胞体病毒的具有潜在治疗效果的单域抗体， 相比于传统的帕利珠单抗， 这株单域抗体在A型和B型的病毒株中展现出更好的体外中和活性， 同时针对病毒的复制也显示出更好的抑制效果[13].同样值得关注的是KN035单域抗体，KN035是我国第一个自主研发的PD-L1单域抗体药物， 它可以诱导机体产生强烈的T细胞应答， 并抑制肿瘤的生长。对KN035与PD-L1的复合物进行晶体结构解析发现KN035可以竞争性地封闭PD-L1与PD1的几个关键结合位点， 例如Ile54、Tyr56and Arg113[53].在2017年1月，KN035获得临床批准并在3月底开始了第一例临床试验。

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核糖体展示技术：
是一种新型体外筛选分子进化功能性蛋白质的强有力的工具。该技术将基因型和表型联系在一起，无细胞环境下形成三元复合物mRNA-核糖体-蛋白质，进而从蛋白展示文库中找到编码针对目标蛋白的基因序列，成功应用于抗体库的构建和筛选。利用PCR 扩增VHH 片段和间隔序列（geneIII，来自辅助噬菌体M13KO7），同时引入核糖体展示元件、酶切位点、组氨酸标签等。然后，采用重叠延伸PCR，将VHH 片段和间隔序列重组构建核糖体展示纳米文库。

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纳米抗体的优势：
兼具小分子物质（易结合和生产成本低）和单克隆抗体（高亲和力和特异性）的双重优势。
① Nbs缺乏翻译后修饰及糖基化过程、高亲水性、结构简单→可在细菌和酵母菌中表达，很少发生聚集，稳定性高，耐高温。
② 抵御胃肠道蛋白质降解，提示Nbs可以口服给药。
③ CDR3形成稳定的凸型结构，可深入抗原内部更好地结合抗原。
④ Nbs缺乏Fc片段，避免普通抗体含有的Fc段所引起的补体反应
⑤与人VH片段序列同源性高，生物相容性好，免疫原性低
⑥ 半衰期短，对干细胞迁移、毒素传递、非侵入性体内成像来说是有利的；对慢性病治疗来说，应延长半衰期。

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单域抗体应用优势：1. 易于生产
单域抗体具有结构简单和稳定的特点，使其易通过各种体外表达系统进行生产，其中以大肠杆菌或酵母发酵生产较为常见。在
大肠杆菌表达系统中，大多以C 端六聚组氨酸
( His6) 标记单域抗体，随后通过固定化金属亲和层
析( immobilized metal ion affinity chromatography，
IMAC) 提纯。在酵母表达系统中，毕赤酵母是最常
用的酵母表达宿主细胞。目前实验室条件下，大肠
杆菌和酵母表达系统均已实现单域抗体的高产量，
产量可大于10 mg·L － 1。而在大生产中，Ablynx 公
司通过毕赤酵母表达系统，已实现产量大于1 g·L － 1
的低成本生产［17］。
传统单抗为了保障生产中正确的结构折叠和糖
基化等翻译后修饰，较多采用哺乳动物细胞株进行
生产，故生产成本高昂，耗时很长，而单域抗体的生
产模式能大幅降低成本和提升生产效率。

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纳米抗体合成库的优势：
抗原的高毒性或致病性而不能免疫骆驼时，或者在某些情况下抗原是自身免疫抗原和一些非免疫原性小分子化合物，不能在天然纳米库中筛选出针对该目标抗原的特异性抗体
为了解决这些问题，合成文库可能是一种有效的替代方法，合成文库在某些特殊情况下是分离某些抗原特异性Nbs 的良好来源，可以克服免疫文库和天然文库的瓶颈，影响一个抗体库的实用性的重要因素是库的容量以及库的多样性。

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纳米抗体库的人源化：
1. 表面氨基酸人源化法
纳米抗体人源化的一般原则是在有效地降低免疫原性的同时，能够保证较高的亲和力、活性、热稳定性和产量等。
VHH人源化第一步可考虑对骨架区FR2进行改造，即将4个疏水性残基分别突变为人VH 的亲水性残基。
对VHH FR2骨架区进行人源化首先分别对4个残基进行突变或通过生物信息学模拟找出对构象影响较小的残基。
在选择好对FR2突变的位点后，考虑对其他3个骨架区(FR1、FR2以及FR3)进行人源化。
研究发现另外3个骨架区对VHH空间构象的影响不大，因此可通过计算机模拟或与人胚系基因对比分析进行人源化改造。
2．VHH人源化通用框架移植法

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①VHH 中的CDR3 区更长，并且可
以通过形成稳定而丰富的大凸环抗原结合构
象［3］，嵌入抗原分子的裂缝及沟槽中，提高了抗体
的特异性和亲和力，也使其具有广泛的抗原结合活
力； ②VHH 的CDR1 区和FR2 区存在半胱氨酸残
基（Cys），可以与CDR3 区中的Cys 残基形成二硫
桥，使可变区的稳定性增强［4-5］；③VHH 缺少Fc 段，
避免了补体反应，因而免疫原性较弱，生物相容性
较好［6］；④VHH 抗体表面约有10 个不同于VH 抗
体的氨基酸，更易进行改造；⑤VHH 包含更多的目
标抗原表位［7］；⑥VHH 抗体片段对不同的温度有极
大的稳定性［8］；此外，VHH 抗体能在细胞内很好地
发挥功能，对酶类的中和作用较强，这些特点也大
大促进了其在生物体内免疫代谢的调节作用［9］。

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CALL001引物：
和驼类VH/VHH基因的信号肽区一致，和人类-3VH基因高度同源。
CALL002引物：
和驼类IgG重链的CH2区基因保守序列一致，能用于驼类mRNA第一链的反转录PCR扩增。