A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology

青龙偃月刀

60 对第58中剩余的洗脱下来的噬菌体进行滴度测定，当实验组和对照组洗脱下来的噬菌体之比超过100时，可以直接挑取单克隆，按照第62步操作，鉴定单克隆特性。如果实验组和对照组噬菌体之比小于100，则需要继续进行再多轮次的筛选。
61 第三天，将洗脱得到的噬菌体进行扩增，用于下一轮筛选，噬菌体的扩增操作步骤同38-60。

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筛选抗原结合子 耗时4天。
62. 第59步种感染噬菌体的TG1菌液进行10倍稀释，选择几个稀释度的菌液，取100ul涂板，37℃培养过夜。
63. 从第62步的平皿种挑取96-192个单克隆菌落，接种到96孔圆底深孔板中，每孔加入100ul的2 × TY-GA培养液，同时设置转化有无关Nb的TG1作为阴性对照，一孔空白对照检测各孔之间有无污染。37℃孵箱中，静置培养。 每孔加入甘油后，可以放于-80℃长期保存作为主板。
64. 取10ul主板中的菌液接种到含有1ml2YT-GA培养基中，37℃，200rpm×3小时，细菌差不多增长到指数生长期，每孔加100μl 10 mM IPTG ，37℃，200rpm振摇4-6小时，3200g离心10min，弃上清，留下菌团，整板冻存于-20℃，30min，菌团可在-20℃保存数月而不失去Nb活性。

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65. 深孔板放置室温下融化菌液，每孔加入100ulPBS，从周质中释放出纳米抗体。常温，700rpm，摇床上震荡孵育30min。3200g离心10min，小心取上清，90ul/孔，转移到一个新的96孔V-底深孔板中，液体中差不多有500nM的纳米抗体。
66. 常规ELISA检测，五倍稀释周质提取液，通过抗HIS标签的二抗，检测纳米抗体。
67.（可选）周质提取液还可以用于生化，细胞或者生物物理筛选，进一步鉴定纳米抗体的功能特性。 对于膜锚定蛋白，通过流式细胞术进行筛选以评估纳米体在天然膜环境中对靶点的特异性。

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68. 融化第63步中主板的菌液，取5ul表达纳米抗体的细菌转移到45ul的无菌水中，取5ul的细菌培养液作为模板进行PCR鉴定。
69 电泳分析PCR产物，大小是否正确，正确的菌落进行测序，CDR3区高度相似，长度相同，>80%的序列一致，归为同一家族，同一家族的纳米抗体来源于同一个B-细胞系，结合靶抗原的同一个表位。

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表达和纯化纳米抗体 耗时5天
为得到高产量，可溶性好的纳米抗体蛋白，可以用大肠杆菌WK进行表达。
70. 从第63步中的主板中转接单克隆菌液到5ml的LB-GA培养基中，37°C培养，提取质粒，转化WK6细菌。挑取单克隆转接到装有10ml含1mM氯化镁的LB-GA培养基中，37 °C ，170 rpm震荡培养。
71. 取3ml来自步骤71的菌液，接种到含1mM氯化镁的330ml的TB-GA培养基中，37℃，170rpm，振摇到OD=0.7，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，28 °C ，170 rpm震荡培养过夜。
72.常温，9000g离心15分钟，用15ml的冰预冷TES进行细菌的重悬，冰上孵育，摇床上摇动至少一个小时，再加入30ml的TES/4缓冲液，冰上放置，摇床上摇动45min，10000g离心30min，收集上清，即为周质提取物。73. HIS纯化纳米抗体，产量大约为1-10mg/L，纯度能达到≥ 95%，如果要满足结晶伴侣的需求，需要进一步通过离子交换进行抗体的纯化。

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步骤1-3：蛋白保存和分析，耗时1天

步骤4-6：骆驼免疫，耗时6周

步骤7-10：采血和淋巴细胞分离，耗时1天

步骤11-12：血清阳转率分析，耗时2天

步骤13-18: 分离总RNA，耗时1天

步骤19-20：cDNA合成，耗时半天

步骤21-36：构建免疫库，耗时5天

步骤37-45：制备和扩增噬菌体颗粒，耗时2天

步骤46-61：抗原递呈和Nb筛选，每轮耗时3天

步骤62-67：筛选鉴定抗原结合子，耗时4天

步骤68-69：测序,耗时2天

步骤70-73：表达纯化纳米抗体，耗时5天

黄帮主

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