关于纳米抗体的读文献笔记

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VHHs开发为药物经历三个阶段：
第一个十年，1993–2003，开发阶段，这一阶段的主要贡献有：
①  首次引入VHH概念; ②对VHH进行测序，进行胚系抗体基因和基因亚家族进行分类；③建立VHH的噬菌体抗体筛选技术，筛选到抗原特异性的单域抗体，还有一些酶抑制剂；④ 确定了一些VHH-抗原复合物的晶体结构；⑤ 建立了VHH的原核和酵母表达系统，鉴定生物学特性；⑥ 将VHH开发成免疫纯化和免疫灌注的试剂。

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第二个阶段，2003–2013年， VHHs开始引起关注，文献暴增，到2013年超过1000篇。
将近50家机构，实验室进行驼类VHHs的研究，主要研究将VHH用于科研，生物科技，和药物研究中。
这一阶段的标志性事件有Ablynx等公司研发的几个纳米抗体开始了临床前和临床研究，一些纳米抗体作为治疗和显像试剂。
研制得到的一些单域抗体包括① 抗血液蛋白因子vWF控制血小板聚集和防止血液凝固；② 病毒感染RSV；③ 毒液毒素; ④抗IL6-R治疗类风湿性关节炎；⑤ 放射性标记的纳米抗体用于Her2阳性的肿瘤影像诊断；
技术上的进步包括VHH在不同的异质系统中进行表达，构建了各种双价，多价的VHHs抗体。

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第三阶段，2014年–现在
越来越多的文献涌现，更多的纳米抗体进入临床研究。
Ablynx开始和大的药厂合作，比如Merck, Boehringer Ingelheim, Sanofi等
第一个纳米抗体获批

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纳米抗体除了作为疾病诊断与检测的工具外，有多种进入各期临床研究，应用于癌症、自身免疫病、呼吸系统、血液系统等疾病。非人源的纳米抗体如果长期用于临床可能会产生不同程度的免疫反应，影响治疗效果，此外存在迅速降解、药效下降以及提高排异反应的风险，因此，纳米抗体进行人源化越来越被关注。

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人源化原则：有效地降低免疫原性的同时，保证较高的亲和力，活性，热稳定性和产量等。
① 可考虑对骨架区FR2进行改造，即将4个疏水性残基突变为人VH的亲水性残基，影响稳定性或者亲和力，因此对VHH FR2骨架区进行人源化，首先分别对4个残基进行突变，或者通过生物信息学模拟找出对构象影响最小的残基。但是，也有报道人源化时应保留这4个疏水性残基。
② 另外3个骨架区FR1，FR3，FR4对VHH空间构象影响不大，可通过计算机模拟或者人胚系基因对比分析，进行人源化改造。
③ 更为简单的办法是，设计人源化通用框架，将CDR区嫁接至人源化通用框架上构建人源化纳米抗体，不仅能够保留原先的热稳定性与抗原特异性结合能力，而且也不影响生物活性，h-NbBcⅡ10（FGLA） 是目前设计出最理想的一个人源化纳米抗体通用模板。
④ HCAb转基因小鼠，是抑制小鼠的内源性抗体基因表达，将缺乏CH1的人源重链抗体基因注入到小鼠体内，通过抗原免疫刺激产生亲和力成熟的重链抗体，使用这种方法可以获得亲和力好，稳定性高且可溶的单域抗体。但是花费比较高，尚不能普及。

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纳米抗体的基因融合：纳米抗体可以和HIS标签，C-MYC或者HA标签，用于纯化和检测。
此外有很多商品化标签也可以用于蛋白的纯化和检测，如ALFA，C-tag，Spot-Cap等
Avi标签可以用于抗体的生物素化。纳米抗体融合在5‘端，充分保留溶剂暴露面和抗体决定簇。为了提高纳米抗体在血液中循环时间，可以将纳米抗体和血清白蛋白融合一起。
融合基因之间加入 linker (Gly4Ser)3 增加两部分蛋白的柔韧性，增加抗蛋白酶和稳定性。
纳米抗体制备成双价抗体可以提高抗体的亲和力。
两个识别同一抗原的两个不同表位可以制备双特异性抗体。在抗原上能形成类似夹子结构，为了增强夹子的结合能力，可以对linker区域的长度以及纳米抗体之间的顺序进行调整。识别不同抗原的纳米抗体也可以制备双特异性抗体，比如BiTEs结构的双抗。
还可以构建三价，四价等多价抗体，但是随着蛋白分子变大，产率也会有所下降。

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纯化的Nbs与其他蛋白质可以通过甲醛、戊二醛等交联剂进行化学偶联，交联作用主要发生在赖氨酸的ε-氨基上，纳米抗体序列中通常具3-4个赖氨酸，并且离CDR比较远。如果CDR区存在赖氨酸，则不适合进行化学交联。另外，交联后的纳米抗体和抗体的结合能力可能会下降。

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纳米抗体存在半衰期短的劣势，需要采取延长半衰期的改造措施，如Fc融合、PEG化、白蛋白融合等。

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纳米抗体的特殊结构特征，使得其应用范围大为拓展：

① 纳米抗体结构简单，可以利用大肠杆菌和酵母进行高效表达。纳米抗体也可以在益生菌如乳酸菌中高效表达，即Lactobody。
② 由于是单域抗体，很容易与其他分子偶联，如连接放射性同位素、连接毒素制备Immunotoxin等。
③ 适合作为胞内抗体表达，即Intrabody，可以靶向胞内乃至核内蛋白。Chromobody是一种特殊的胞内抗体，结构为纳米抗体与荧光蛋白融合，从而可以用于监测胞内生化过程。
④ 纳米抗体也可以应用于药物递送系统中。

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VHHs很适合作为诊断试剂，但是作为感染性疾病的诊断，现有的文献不多，一个原因可能是核酸检测方法对病毒感染诊断有很强的敏感性，占领了相关市场。然而，就检测速度而言，基于抗体的快速检测方法显然超过了基于DNA和RNA的检测方法。对于一些已知在其结构蛋白质中表现出抗原多样性的病毒，以VHH 为基础的检测方法是一个挑战，除非有广泛反应，但高度特定的VHH可用。比如人类诺如病毒一种抗原多样性病毒，分为两个主要基因群，有40多种不同的基因型，诺如病毒的爆发速度惊人，有一个快速和稳健的诊断方法有助于控制疫情。一种能识别诺如病毒保守的突出区域的VHH可用于开发为快速诊断试剂，如胶体金试剂。和商品化的ELISA试剂盒比较，特异性升高，而灵敏度有所降低，使用多价VHHs，可能会提高试剂的灵敏度。