关于纳米抗体的读文献笔记

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纳米抗体分子示意图 (a) 蓝色部分代表的为重链抗体，和传统抗体比，缺乏轻链和CH1区。 (b)  纳米抗体的二维示意图，从FR1-FR4区之间包含9个β-链，其中CDR1(绿色），CDR2 (橙色), CDR3 (红色). 四个保守的位点突变显示为黄色。 (c) 纳米抗体(左, PDB ID 2XA3) 和传统抗体的可变区(右, PDB ID 5IBU) 进行比较，由CDR形成的抗体结合部位俯视和侧视图，轻链可变区以灰色带表示，其中轻链的CDR1-3区以紫色带表示。 (d) 抗-PD-L1的纳米抗体(PDB ID 5JDS)的带状图，其中灰色代表CDR1-3之间形成的分子间二硫键。

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结构研究揭示了纳米抗体如何保持可溶性，以及它们与抗原靶标之间的相互作用。
和传统抗体一样，纳米抗体也是通过CDR3区和抗原之间相互作用结合。值注意的是，一个细长的CDR3环能使VHH和抗原之间的相互作用更为多样性。
与常规抗体不同，纳米抗体和抗原之间的相互作用可以产生多种形态的构象，有利于抗体识别蛋白裂缝/囊袋，包括酶活性位点等常规抗体不容易识别的表位。如下图，各纳米抗体可以以穿透（a)，平摊(b)，凸起(c），凹陷（d)等多种构象形态和抗原进行结合。

对90个非变性的VHH/蛋白抗原结构的进行结构分析，显示VHH CDRs比传统抗体具有更大的结构多样性。

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蛋白质的稳定性和可逆性在很大程度上取决于环境条件(如pH、缓冲液、盐和蛋白质浓度)，纳米抗体通常具有高的热稳定性。一般来说，纳米抗体的熔化温度在50-80℃，经过反复几次冻融依然能保持有功能活性，这使得纳米抗体很适合作为诊断试剂。纳米抗体在高温下具有高度可逆性，完全的热力学可逆性作为诊断试剂使用很可能是一个“最好的情况”现象，不过作为治疗应用，应为纳米抗体可能存在的高温下聚集现象，需要进行更多的实验来进行评价。

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纳米抗体在治疗领域中应用抗体作为治疗药物的使用源于其生物相容性和对靶抗原的高亲和力/特异性。纳米抗体也可以用于治疗性抗体的使用，治疗性抗体数据库中列出了31种基于vhh的药物（2019年数据），范围从临床前到临床开发。VHH的治疗靶点包括但不限于肿瘤、炎症、抗病毒、神经病学、抗感染剂和罕见的血液病。

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2019年2月，FDA批准了首个纳米抗体药物Cablivi(Caplacizumab，赛诺菲)，用于治疗获得性血小板减少性紫癜。VHH独特的理化性质如体积小、结合活性高，比传统抗体具有优势。基因长约360bp，能很好地在原核/真核系统中进行表达，以及多价抗体的融合表达。
VHH结构域与人类VH3基因具有高序列同源性，在治疗应用中就有很好的低免疫原性。Cablivi的临床实验报告就显示了该药物的低免疫原性，不过尽管具有高度的序列相似性，人们仍在寻求纳米抗体的人源化策略。

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纳米抗体作为治疗性抗体一个需要主要的问题是纳米抗体的流体力学半径小于肾小球滤过极限值，这样会导致肾脏快速清除，药代动力学差(PK)，从而限制治疗效果。常规抗体有Fc段，能FcRn可以延长半衰期，而纳米抗体缺少Fc段，半衰期短。同时在某些情况下，这种快速清除是一种优势(如纳米抗体作为诊断成像试剂)，当下已经有一些策略，如和Fc段融合，制备双价或多价纳米抗体，和HSA血清蛋白，抗血清白蛋白等融合，能有效改善药物的药代动力学。此外还采取一些化学方法，如聚乙二醇化和脂化都能有效提高半衰期。

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纳米抗体为靶向治疗性疾病提供了新的技术(如癌症和病毒感染)，纳米抗体已经用于靶向HER2抗原的CAR-T细胞治疗，还有双特异的HER2/CD20 CAR-T细胞治疗。针对病毒蛋白，如来自H5N1的流感病毒唾液酸酶或来自人类呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白F，可以预防小鼠的病毒感染。Laursen等人将得到的针对流感A血凝素的两个纳米抗体 (SD36和SD38) 以及两个针对流感B血凝素的纳米抗体进行串联构建的多价纳米抗体，具有增强的病毒交叉反应性/效力，可能用于广泛的治疗应用。

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口服纳米抗体药物
传统治疗抗体通常通过静脉或皮下途径给药，采用其他途径，如口服给药可以用于一些适应症，比如预防和/或治疗消化系统疾病。对于这种治疗用途，抗体必须在胃肠道环境下保持功能。如针对大肠杆菌F4菌毛和空肠弯曲杆菌鞭毛的VHH结构域作为潜在的抗菌药物，需增强抗蛋白酶活性和低pH下的稳定性。口服纳米抗体药物代替传统的静脉/皮下治疗性抗体治疗炎症性肠病方面，进展比较好的有，一种靶向抗肿瘤坏死因子(TNF) α的纳米抗体V565，可以穿透被破坏的上皮细胞，对粘膜上皮屏障受损的炎症性肠病患者有效。

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诊断和小分子检测
针对半抗原产生的抗体可用于检测和定量分子，如环境污染物或药物生物标志物。
结构分析半抗原通常和传统抗体结合的成键口袋通常位于VH和VL界面。
纳米抗体和蛋白结合的的结构数据已经很多，和半抗原结合的结构数据还较少。

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纳米抗体识别半抗原的形态有多样性，如两个靶向两种不同的偶氮染料(活性红1和红6)半抗原的纳米抗体，显示了半抗原和纳米抗体结合的界面类似传统的VH/VL和半抗原结合的界面。纳米抗体虽然缺少VL链，但是延长的CDR3区或者CDR2/3区能为低分子的半抗原形成充分的成键口袋。
VHH结构域，揭示了半抗原与传统VH/ vl -半抗原配合物的界面作用类似于VH结构域抗活性红6半抗原中的两个铜离子和纳米抗体的两个组氨酸结合，亲和力得到提升，解离常数为20nM。
抗咖啡因的纳米抗体 是两个纳米抗体和小咖啡因结合形成2：1的比例结合。