关于纳米抗体的读文献笔记

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口服纳米抗体药物
传统治疗抗体通常通过静脉或皮下途径给药，采用其他途径，如口服给药可以用于一些适应症，比如预防和/或治疗消化系统疾病。对于这种治疗用途，抗体必须在胃肠道环境下保持功能。如针对大肠杆菌F4菌毛和空肠弯曲杆菌鞭毛的VHH结构域作为潜在的抗菌药物，需增强抗蛋白酶活性和低pH下的稳定性。口服纳米抗体药物代替传统的静脉/皮下治疗性抗体治疗炎症性肠病方面，进展比较好的有，一种靶向抗肿瘤坏死因子(TNF) α的纳米抗体V565，可以穿透被破坏的上皮细胞，对粘膜上皮屏障受损的炎症性肠病患者有效。

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诊断和小分子检测
针对半抗原产生的抗体可用于检测和定量分子，如环境污染物或药物生物标志物。
结构分析半抗原通常和传统抗体结合的成键口袋通常位于VH和VL界面。
纳米抗体和蛋白结合的的结构数据已经很多，和半抗原结合的结构数据还较少。

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纳米抗体识别半抗原的形态有多样性，如两个靶向两种不同的偶氮染料(活性红1和红6)半抗原的纳米抗体，显示了半抗原和纳米抗体结合的界面类似传统的VH/VL和半抗原结合的界面。纳米抗体虽然缺少VL链，但是延长的CDR3区或者CDR2/3区能为低分子的半抗原形成充分的成键口袋。
VHH结构域，揭示了半抗原与传统VH/ vl -半抗原配合物的界面作用类似于VH结构域抗活性红6半抗原中的两个铜离子和纳米抗体的两个组氨酸结合，亲和力得到提升，解离常数为20nM。
抗咖啡因的纳米抗体 是两个纳米抗体和小咖啡因结合形成2：1的比例结合。

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Paratope和Epitope是抗体和抗原之间结合的区域，其中Paratope是抗体的一部分，可称为抗体决定簇，通常是抗体的CDR区。Epitope是抗原的一部分，称为抗原表位，或者抗原决定簇。对于那些能够在PDB数据库中找到蛋白氨基酸序列一致性大于30%或者更高的序列，那么可以采用同源建模的方法进行建模。推测对于没有同源序列的序列，那么就需要用从头建模的方法，从头建模的方法目前alphafold做的最好

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抗甲氨蝶呤的纳米抗体VHH53的结构研究揭示了一个非典型的半抗原识别位点，甲氨蝶呤将自己插入到CDR1环的下方并穿过该环形成穿线结构(图3)。这种“穿线”将90%的半抗原结构进行了包埋，比传统的抗体VH/VL包裹半抗原区域要多很多，具有很强的亲和力(KD=5 nM)和特异性。另外，还有抗三氯卡班，抗皮质醇的纳米抗体也和抗抗甲氨蝶呤的纳米抗体相似，半抗原也是能和CDR1下面的隧道相连，说明CDR1“隧道”可能是一种常见的机制，作为设计新型抗半抗原纳米抗体的模板。

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CDR移植是一种用于纳米抗体工程的常用方法。即将纳米抗体的CDR区插入到纳米抗体/传统抗体的相应位置，可实现某些功能的改进，如抗体的亲和力成熟，保持高热力学稳定性，提高表达水平等。亲和力成熟的改造包括修改基因序列，如编码CDR环上的残基以引入或优化和抗体之间的相互作用(如:氢键、盐桥、范德华力）。便捷的DNA合成技术已经使得对纳米抗体的基因进行定点突变变得十分容易。也可以建立组成型的突变库，有目的地重新进行筛选。另外现在更多地是采用计算机相关软件进行辅助设计。

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Koide等人证实了VHH和抗原的界面更适合亲和力的成熟，采用结构导向，两步库设计/筛选，得到亲和力提高近100倍，解离常数达到皮摩尔水平的针对抗RNase A的改构抗体。Cheng等人采用了同源建模和分子对接的计算模拟亲和力成熟，得到抗cd47的纳米抗体，亲和力提高>87倍，热稳定性也提高了7℃。

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纳米抗体合成库合成库对于有毒蛋白，致病抗原，低免疫原性，有保守表位的蛋白等，可以用合成库进行筛选。
合成库还可以用于筛选有特定构象的抗原，这不仅可以了解抗原的结构，还可以了解蛋白质构象转变的能量变化。
早期的合成库主要是针对纳米抗体和抗原结合的界面，如在通用的纳米抗体骨架上对CDR3区进行改造。
最近的文献有将核糖体和噬菌体展示技术进行结合,模拟常见的纳米抗体结合部位(如凹,凸和环/突出)，并从中筛选到针对膜蛋白的构象选择性单域抗体。
还有人源化单域抗体库NaLi-H1，能够提供高功能的VHH抗体。

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Kruse和Manglik设计的纳米抗体合成库，是酵母表面展示的纳米抗体库。
利用该合成库得到可溶性蛋白，非纯化蛋白。
McMahon等人利用针对两种不同的GPCRs (b2AR和A2A腺苷受体)筛选到的构象特异性VHH域，其中b2AR激活状态下和特异性克隆Nb.C200形成稳定的共结晶结构。
此外，使用这个VHH合成库，Wingler等人解析出血管紧张素II的I型受体在活性状态下的晶体结构，并进行了人源化和亲和力成熟。
该库已经商品化，可购买。

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纳米抗体结合抗原后能稳定抗原结构，因此常用于结构生物学研究，辅助解析蛋白的结构。G蛋白偶联受体GPCR是一大类膜蛋白受体，参与很多细胞信号转导的过程，调节人体许多生理学机能。GPCR的晶体结构解析对于其功能研究非常重要。β2AR是GPCR的一员，Nb80是一株纳米抗体，可以和β2AR结合，利用Nb-β2AR突变体结合形成的复合物成功解析了激活状态下的β2AR晶体结构。