关于纳米抗体的读文献笔记

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Paratope和Epitope是抗体和抗原之间结合的区域，其中Paratope是抗体的一部分，可称为抗体决定簇，通常是抗体的CDR区。Epitope是抗原的一部分，称为抗原表位，或者抗原决定簇。对于那些能够在PDB数据库中找到蛋白氨基酸序列一致性大于30%或者更高的序列，那么可以采用同源建模的方法进行建模。推测对于没有同源序列的序列，那么就需要用从头建模的方法，从头建模的方法目前alphafold做的最好

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抗甲氨蝶呤的纳米抗体VHH53的结构研究揭示了一个非典型的半抗原识别位点，甲氨蝶呤将自己插入到CDR1环的下方并穿过该环形成穿线结构(图3)。这种“穿线”将90%的半抗原结构进行了包埋，比传统的抗体VH/VL包裹半抗原区域要多很多，具有很强的亲和力(KD=5 nM)和特异性。另外，还有抗三氯卡班，抗皮质醇的纳米抗体也和抗抗甲氨蝶呤的纳米抗体相似，半抗原也是能和CDR1下面的隧道相连，说明CDR1“隧道”可能是一种常见的机制，作为设计新型抗半抗原纳米抗体的模板。

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CDR移植是一种用于纳米抗体工程的常用方法。即将纳米抗体的CDR区插入到纳米抗体/传统抗体的相应位置，可实现某些功能的改进，如抗体的亲和力成熟，保持高热力学稳定性，提高表达水平等。亲和力成熟的改造包括修改基因序列，如编码CDR环上的残基以引入或优化和抗体之间的相互作用(如:氢键、盐桥、范德华力）。便捷的DNA合成技术已经使得对纳米抗体的基因进行定点突变变得十分容易。也可以建立组成型的突变库，有目的地重新进行筛选。另外现在更多地是采用计算机相关软件进行辅助设计。

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Koide等人证实了VHH和抗原的界面更适合亲和力的成熟，采用结构导向，两步库设计/筛选，得到亲和力提高近100倍，解离常数达到皮摩尔水平的针对抗RNase A的改构抗体。Cheng等人采用了同源建模和分子对接的计算模拟亲和力成熟，得到抗cd47的纳米抗体，亲和力提高>87倍，热稳定性也提高了7℃。

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纳米抗体合成库合成库对于有毒蛋白，致病抗原，低免疫原性，有保守表位的蛋白等，可以用合成库进行筛选。
合成库还可以用于筛选有特定构象的抗原，这不仅可以了解抗原的结构，还可以了解蛋白质构象转变的能量变化。
早期的合成库主要是针对纳米抗体和抗原结合的界面，如在通用的纳米抗体骨架上对CDR3区进行改造。
最近的文献有将核糖体和噬菌体展示技术进行结合,模拟常见的纳米抗体结合部位(如凹,凸和环/突出)，并从中筛选到针对膜蛋白的构象选择性单域抗体。
还有人源化单域抗体库NaLi-H1，能够提供高功能的VHH抗体。

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Kruse和Manglik设计的纳米抗体合成库，是酵母表面展示的纳米抗体库。
利用该合成库得到可溶性蛋白，非纯化蛋白。
McMahon等人利用针对两种不同的GPCRs (b2AR和A2A腺苷受体)筛选到的构象特异性VHH域，其中b2AR激活状态下和特异性克隆Nb.C200形成稳定的共结晶结构。
此外，使用这个VHH合成库，Wingler等人解析出血管紧张素II的I型受体在活性状态下的晶体结构，并进行了人源化和亲和力成熟。
该库已经商品化，可购买。

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纳米抗体结合抗原后能稳定抗原结构，因此常用于结构生物学研究，辅助解析蛋白的结构。G蛋白偶联受体GPCR是一大类膜蛋白受体，参与很多细胞信号转导的过程，调节人体许多生理学机能。GPCR的晶体结构解析对于其功能研究非常重要。β2AR是GPCR的一员，Nb80是一株纳米抗体，可以和β2AR结合，利用Nb-β2AR突变体结合形成的复合物成功解析了激活状态下的β2AR晶体结构。

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构象选择性纳米抗体还可以靶向非GPCR的抗原，如蛋白酶和整合膜蛋白受体。如，Kromann Hansen等人发现了两个针对尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的纳米抗体，其中一个纳米抗体是竞争性活性位点抑制剂，另一个VHH是变构调节剂。生物物理测量结合VHH共络合x射线结构有助于理解反平行到平行构象之间的平衡。

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构象特异性纳米抗体不仅提高了我们对GPCR生物学的认识，而且进一步加深了我们对整体膜蛋白受体生物学的认识。有助于理解靶蛋白在激活状态下的分子状态，及允许使用纳米抗体锁住药物构象中的受体，促进新药物的发现。

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与靶抗原ph依赖性结合的抗体的工程化改造如筛选与中性ph相比在酸性ph下表现出降低的抗原结合的抗体。
抗体可以是经工程化的以在中性ph(例如ph7.4)下保持高亲和力抗原结合，并且在酸性ph(例如ph4.5至6.0)下显示出降低的结合。
促进增强抗原清除，可使得能够进行更低频率地或更低地抗体给药。
通常，ph依赖性抗体-抗原结合依赖于可电离的组氨酸残基的存在，将组氨酸突变随机引入到纳米抗体库的互补决定区(complementary-determiningregion，cdr)中。