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腺病毒通用晚期表达盒的构建及4型腺病毒右侧末端片段克隆及测序

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发表于 2019-11-16 21:24:40 | 显示全部楼层 |阅读模式
腺病毒通用晚期表达盒的构建及4型腺病毒右侧末端片段克隆及测序


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 楼主| 发表于 2019-11-16 21:32:41 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2019-12-15 07:24 编辑

摘要:
在腺病毒载体的构建过程中,早期和晚期启动子的选择,构建以及去除末端蛋白,克隆末端序列是至关重要的。
我们构建了
①腺病毒通用晚期表达盒;
②应用改良的碱变性法克隆了4型腺病毒右侧小片段(96. 1-100图谱单位);
③ 对末端颠倒重复序列(ITR)进行了测序
为5型腺病毒载体的改建和4型腺病毒载体的构建打下了基础。



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 楼主| 发表于 2019-11-16 22:28:25 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2019-12-14 17:28 编辑

背景:
在病毒表达载体的研究中, 腺病毒(Adenovirus,Ad)以其繁殖滴度高、病毒基因组大小适中、分子生物学背景比较清楚、可以口服等优点,日益受到人们的重视, 也显示了其作为外源基因表达载体的良好前景。
腺病毒早期和晚期启动子的克隆在载体的构建中是极为重要的。
腺病毒载体构建的方案是:
首先从腺病毒基因组切取带有末端的一段DNA, 该段DNA 常含有El、E3或E4区, 将其克隆于细菌质粒中。
其次克隆一个晚期表达盒(将外源基因插入到AdMLP+TPL之后, 在外源基因的3 端接上poly A)。
将该表达盒插入到上述质粒中Ad DNA 的E1、E3或E4一ITR 区。
最后,从腺病毒基因组中切取一段与克隆到质粒上的那一段DNA 有相互重叠序列的DNA 片段, 经共转细胞内同源重组, 筛选出重组病毒。




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 楼主| 发表于 2019-11-16 22:30:29 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 17:47 编辑

腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白,分为早期表达和晚期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白,晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白,并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
腺病毒的单细胞增殖周期如图:
病毒通过其纤维蛋白与人细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体相互作用而吸附到细胞表面。(步骤1)
通过胞吞作用进入细胞,这个过程依赖于第二个病毒粒子蛋白--五联体基底与细胞的整合蛋白(阴影圆柱)相互作用(步骤2)。
部分分解发生在病毒颗粒进入细胞质之前(步骤3)
进一步脱衣壳后,核心蛋白VII与基因组相连一起进入细胞核(步骤4)
宿主细胞RNA聚合酶II转录系统转录早期ELA基因(步骤5)
经过选择型剪接加工后的EIA mRNA输出到细胞质(步骤6)
EIA蛋白由细胞翻译装置合成(步骤7)
这些蛋白再次进入细胞核内(步骤8)
在细胞核内它们调控细胞和病毒基因的转录。较大的EIA蛋白刺激细胞RNA聚合酶II转录病毒早期基因(步骤9a)
在病毒感染早期,病毒VA基因也开始由宿主细胞RNA聚合酶III转录(步骤9b)
早期mRNA前体被加工,输出到细胞质(步骤10),并得以翻译(步骤11)
这些早期蛋白包括病毒复制蛋白被输入到细胞核内(步骤12)并与特定的宿主细胞蛋白协作完成病毒DNA合成(步骤13)
复制产生的病毒DNA分子可以作为下一轮复制的模板(步骤14)或转录晚期基因的模板(步骤15)
一些晚期启动子能仅仅通过病毒DNA复制而被激活,但主要晚期转录单元的最有效转录需要晚期IVa2蛋白和L4蛋白的参与,加工后的晚期mRNA在EIB 55KDa和E4 ORF6蛋白作用下被选择性地运输出核(步骤16)
它们在细胞质中的有效翻译(步骤17)需要对抗细胞防御机制的VA RNA,VA-RNA-I,以及晚期L4 100KDa蛋白。
当它们和其他结构蛋白入核时,晚期L4 100KDa蛋白还在三聚六邻体组装中起分子伴侣的作用,就像这些蛋白及其他一些结构蛋白被运送到细胞核一样(步骤18)。
在核内这些蛋白组装成的衣壳与子代病毒基因组形成非感染性的未成熟病毒粒子(步骤19)
病毒的组装需要位于基因组左端的包装信号以及IVa2和L4 33KDa蛋白。
未成都胡的病毒颗粒包含一些成熟的前体蛋白,当这些前体蛋白被病毒L3蛋白酶切割并组装进入病毒粒子核心,形成成熟的感染病毒(步骤20)
子代病毒颗粒释放(步骤21)


引用来自病毒学原理

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 楼主| 发表于 2019-11-16 23:10:08 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 21:26 编辑

实验所用材料:
A549细胞(人肺癌传代细胞株)
人类4型腺病毒(Adenovirus type 4, Ad4) 毒株。moi=0.4的比例感染A549细胞,37℃培养72小时,病变达到+++---++++时,收获病毒。


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 楼主| 发表于 2019-11-17 23:00:40 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 21:28 编辑

腺病毒DNA的提取
现在已有简单高效的试剂盒使用。
详细实验流程可以参考文献
三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析
http://www.soberreading.com/forum.php?mod=viewthread&tid=109&extra=page%3D1
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 楼主| 发表于 2019-11-17 23:52:30 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 21:31 编辑

改良的碱变性法可以去掉Ad4右侧(3‘端)末端蛋白
将20ug腺病毒基因组用EcoR I酶切,回收3'端的6K左右的片段。
用Xho I再次进行酶切,回收1.5k左右的片段。
碱变性去除末端蛋白
(特别重要)。
利用Xho I/Sma I双酶切质粒pBLUESCIPT KS,将上述片段插入酶切处理质粒中,得质粒pBA。



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 楼主| 发表于 2019-11-18 00:12:24 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 21:47 编辑

Ad4 DNA右侧末端ITR区测序(这一步骤现在已经可以不用如下面步骤这么复杂,直接可以测序pAB质粒)
Xho I:C/TCGAG  Sal I G/TCGAC两个酶为同裂酶,用Xho I/Bam H I双切pBA,Sal I/Bam H I双切pGEM11ZF,构建pGEM11A。
将pGEM11A中AD4序列克隆于M13mp18中。制备单链DNA,进行测序。
和NCBI上序列进行比对,基本一致。
Accession: MP202818.1 GI: 1743031001
CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTGTGAGTTAATATGCAAATAAGGCGTGAAAATTTGGGGATGGGGCGCGCTGATTGGCTGTGACAGCGGCGTTCGTTAGGGGCGGGGTAACTGATGTGTTTAACGGTCGACGGAATTTTGA

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 楼主| 发表于 2020-6-12 23:28:36 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 21:54 编辑

腺病毒通用晚期表达盒的构建
pM1含有AdMLP+TPL片段的质粒。
ECoRI和Sal I酶切pM1的AdMLP+TPL片段定向克隆插入pGEM11ZF,获得pGA。再将SV40POLYA片段插入到pGA中,获得pGAS。
该质粒含晚期表达盒。
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 楼主| 发表于 2020-6-12 23:43:53 | 显示全部楼层
本帖最后由 青花瓷 于 2020-6-21 22:01 编辑

腺病毒通用晚期表达盒的构建

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