噬菌体展示技术及其在抗体制备中应用的研究进展

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噬菌体展示技术及其在抗体制备中应用的研究进展

本文对噬菌体展示抗体技术进行了系统性阐述，包括载体、蛋白融合、引物设计、构建方法、筛选技术等。并对其在抗体制备中的近年来的国内外最新研究进展进行了综述，最后对这一抗体制备技术进行了科学性展望。

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抗体是指动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化成浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
抗体的发展经历了3个阶段：
第一阶段，由于采用传统的免疫方法中抗原通常具有多个抗原决定簇，抗原在进人机体后可激活许多淋巴细胞克隆，产生针对多种抗原决定簇的抗体，由此获得的抗血清即多抗；
第二阶段，1975年Kohler等将杂交瘤细胞和产生特异性抗体的B细胞融合，形成杂交瘤细胞，获得了第一株单克隆抗体；
第三阶段，随着DNA重组技术和其他分子生物学技术的飞速发展，运用分子生物学手段制备了基因工程抗体，被称为第三代抗体。

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鼠杂交瘤制备单克隆抗体技术被证明是十分困难的，而且存在以下缺点：
产生的抗体数量少、需要加以免疫、对人体的一些重要抗原不能有效识别 ，且人体会对鼠源抗体产生抗鼠抗体反应(HAMA)。
第三代抗体主要致力于两方面的研究：
一是对已有单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化(嵌合抗体、重构抗体)、小分子抗体(minibody、diabody、dsFv、ScFv、Fab等)以及抗体融合蛋白的制备；二是通过构建抗体库，不需要免疫抗原即可制得单克隆抗体。

噬菌体展示抗体技术在抗体制备的工程史上具有跨越性的意义。

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噬菌体抗体技术：

噬菌体展示是通过分子生物学手段将外源多肽或蛋白质的基因插入到噬菌体或者噬菌粒基因组中，再以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面的一种技术，最终实现表型与基因型的统一。

噬菌体展示技术是在1985年Smith首次建立，他将外源多肽基因插入丝状噬菌体基因III中，并于PIII蛋白成功展示于丝状噬菌体表面。

1989年，Huse等第一次通过噬菌体展示技术从构建的重组抗体中获得Fab。

噬菌体展示库分为三种：

λ噬菌体展示系统、丝状噬菌体展示系统、T7/T4噬菌体展示系统。

其中丝状噬菌体展示技术应用最为广泛。

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抗体库的构建

载体：抗体库的构建主要基于两大展示系统，

一种是英国剑桥大学创建的Scfv展示系统，比如：pHEN1、pCANTAB系列，

另一种是美国Scripp研究所创建的Fab展示系统，比如：pCOMB3、pCOMB3H等。

展示系统中载体的选择可以有噬菌体载体或者噬菌粒载体，前者可以直接感染细菌，后者需要加入辅助噬菌体，才能感染细菌，在宿主菌中完成DNA的滚环复制和蛋白质的组装。

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蛋白融合：

丝状噬菌体主要有5种外壳蛋白：PⅢ、PⅥ、PⅦ、PⅧ、PⅨ，用于抗体展示系统。

PⅧ展示系统中，融合蛋白的拷贝数比较高，一般为2700个左右，容纳不超过6个氨基酸的抗体多肽，否则会影响到噬菌体组装，从而降低其感染性。

PⅢ展示系统中，可以插入较大多肽甚至整个蛋白，有大于50k的蛋白被成功展示，PⅢ的拷贝数较低，只有5个拷贝左右，有利于筛选到高亲和力配体。

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构建方法：

单链抗体的构建方法主要有两种：

1 将重链基因和轻链基因以不同的顺序进行酶切后，再插入带有连接肽基因序列的表达载体；

这种方法操作相对复杂，而且抗体的多样性容易丢失。

2 重叠延伸拼接法，即用重叠PCR法将重链基因和轻链基因拼接后再同时克隆入表达载体中。

这种方法现在常用。

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引物设计：

天然抗体噬菌体库制备的流程如下：

提取免疫抗体细胞（前、成熟、记忆B细胞）总RNA，常从免疫器官如骨髓、脾脏、淋巴结和扁桃体、外周血中获得。用6核苷酸随机引物，polyT或者是特异性PCR下游引物逆转录形成cDNA第一链。

制备scfv抗体库：用PCR扩增VH、VK、Vλ基因。

制备Fab抗体库：扩增Fd(VH+CH1)基因以及LC基因片段。

设计引物时，两种抗体库的上游引物可以相同，根据抗体骨架区FR1或者引导序列的保守区5’端序列设计；下游引物不同，Scfv抗体库从铰链区(J区)的保守序列设计，Fab抗体库从恒定序列中设计。

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抗体的筛选

通过数次“吸附—洗脱—扩增”，最终使表达了目的基因片段的特异性克隆蛋白得以富集。

根据能否获得纯化的抗原，抗体的筛选的方法主要分为2个方面

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纯化抗原的筛选
固相化抗原筛选法是用纯化后的抗原包被在固相介质(比如酶标板、免疫试管、亲和柱等)上，表达了特异性抗体的噬菌体能针对抗原表位特异性结合，从而被筛选出来。
此种方法也是目前采用最多的方法之一。
抗原液相筛选法是将抗原标记生物素后，利用链亲和素磁珠借助磁场作用力进行噬菌体筛选的一种方法，Labrijn等用此方法对膜蛋白噬菌体库成功进行了筛选。