The SARS-CoV S glycoprotein: expression and functional characterization

青花瓷

The SARS-CoV S glycoprotein: expression and functional characterization

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摘要笔记：
定位S糖蛋白的RBD受体结合区。
构建和表达Tor2病毒株的S蛋白不同片段，表达全长S蛋白的细胞和受体表达细胞在中性PH下能融合，形成合胞体。

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背景资料：
SARS病毒的S蛋白和其他冠状病毒的S糖蛋白相比较，除了S2区有一些保守序列存在外，同源性非常低，氨基酸序列一致性只有20-27%。
本文构建了S蛋白不同区域的表达载体，定位和ACE2结合的RBD区，

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实验所用材料：
根据计算机模拟，合成一系列短多肽，用于免疫新西兰兔，取血清，ELISA和WB检测兔血清中多抗和S蛋白特异性结合能力。有两株短肽免疫后的兔血清效价最高，特异性最好，选其进行本课题中的实验。
D24： DVQAPNYTQHTSSMRGC
P540：PSSKRFQPFQQFGRDC
此外，一株商品化多抗IMG-542，能识别S蛋白的288-303位。
pCDNA3-ACE2质粒，含ACE2编码基因。
pCDNA3-ACE2-ecto, 含可溶性表达ACE2蛋白基因。
MA. VTF7.3(重组痘病毒，表达T7 RNA聚合酶），VCB21R
pSecTag2质粒。

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载体构建：
毒株来源于SARS TOR2.
S蛋白为1255个aa。

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蛋白表达：
构建的一系列真核表达载体转染Vero E6或者293细胞。
转染后4小时，用表达T7聚合酶的VTF7.3重组痘病毒感染细胞，在细胞上清中可以获得可溶性蛋白。
全长S糖蛋白主要存在于细胞裂解物中。

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SARS S蛋白从N端到C端分为S1、S2、跨膜区和胞内结构域4个部分。
本研究中构建的真核表达载体包括：
① 全长S蛋白 (1255个aa)
② 胞外区Se (17–1189位aa）
③④⑤ 截短的S蛋白N区(S276, S537, S756,)
⑥ S蛋白中间区(S272–537)
信号肽区为S蛋白的前16位或者鼠类k链前导链。
S蛋白的758-761位为RNTR，这个基序是一个通用的前提转化酶识别切割的序列K/R–Xn–K/R (n=0, 2, 4 ，6)
所以推测前756位为S1蛋白，其他冠状病毒如JHM的S1为769个aa，OC43的S1为778aa，不过也有冠状病毒S1区域比较短，如229E的S1只有537aa。
所有的真核表达载体，含一个c-MYC标签和一个HIS标签。

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免疫沉降和蛋白纯化：
上清中的表达蛋白和Ni–NTA或者加有特异性抗体的PROTEIN G凝胶进行结合，进行蛋白电泳。
细胞沉淀用NP-40和PMSF裂解后，电泳或者WB检测。由图A狭缝杂交图可见，S蛋白的各真核载体直接转染VERO E6/293细胞中，表达量非常低。
加表达T7聚合酶的痘病毒(VTF7.3)感染后，表达量飙升!
蛋白大小和表达量呈相关性，小蛋白表达量高，大蛋白表达量低。

抗体用anti-c-Myc进行狭缝杂交和WB检测，两实验结果一致。

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用制备的兔多抗对几种S蛋白再进行WB检测：结果如图，D24和几种S蛋白均结合，P540抗体能识别S576，Se，全长S蛋白，不和小片段S结合。
另外，P540多抗灵敏性比D24要好，使用时稀释度可以达到1：10000.

细胞表面上存在S全长蛋白，流式检测到有较低量的表达。

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S蛋白电泳大小比预测值稍大
S276 75KDa
S537 100-110KDa
S576 130-140KDa
Sc/S 200KDa

实验中观察到所有转染S真核表达载体的细胞没有发生细胞病变。