利用CRISPR／Cas方法建立RNase L基因稳定敲除细胞株

青花瓷

最近学习CRISPR/Cas技术，看了原理有点发懵，所以下载了一篇文献仔细解读，花了不少时间，看后觉得豁然开朗，这个技术相信很快会成为实验室标配，并且会越来越简单高效。

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摘要
目的：利用CRISPR／Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。
方法：根据GenBank中RNase L基因序列（基因序列号文中没找到，推测可能是NG-009024.2)，设计RNase L敲除的小指导RNA(sgRNA)序列，构建pCas指导RNA(gRNA)载体；设计供体DNA的同源臂序列，将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段，并将其克隆到pBackZero-T表达载体（这个载体是TAKARA的PCR产物克隆专用载体，非表达载体）上，构建pBackZero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞，用潮霉素B筛选，通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。
结果：成功获得5株RNase L缺失的细胞株。
结论：为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。

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背景资料：
RNase L是一种独特的细胞内核酸内切酶，是已知的核酸酶中唯一需要依赖于2-5腺苷酸激活活性的核酸内切酶 ，在先天性免疫等方面发挥重要作用 。
人RNase L是一种酸性蛋白，由741个氨基酸组成 ，在染色体上基因定位于1q25。
该区域突变与具有遗传倾向的前列腺癌发生有关。RNase L二聚体倾向于在UU或UA核苷酸处断裂病毒和宿主的RNA 。病毒入侵时，RNase L能有效地结合病毒信使RNA(mRNA)，并使其降解从而抑制病毒的复制 ，起到防御病毒入侵的作用。
RNase L包含有3个结构域，分别是N-锚定蛋白结构域、激酶活性蛋白区域和c一核糖核酸酶结构域 。
研究表明，RNase L可能参与多种小RNA(sRNA)的加工生成 ，但其分子机制尚不明确。因此构建RNase L基因敲除的细胞株，对深入研究RNase L的功能及分子机制有着非常重要的意义。

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所用到的主要试剂和材料
pCas—Guide载体(Origene公司)；
pBackZero-T，用来构建供体DNA载体。
pSilencer 2.1-U6 hygro(Ambion公司)，用来钓取潮霉素基因；
RNase L抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG
HEK293细胞。

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构建供体DNA载体
以HEK293细胞基因组DNA为模板，以RNase LKF1、RNase LKR1为引物扩增同源臂片段Kl
以HEK293细胞基因组DNA为模板，以RNase LKF2、RNase LKR2为引物扩增同源臂片段K2
以pSilencer 2.1-U6 hygro质粒为模板，用引物H-F和H-R扩增潮霉素B抗性基因片段Hy
序列见附件。K1,HY,K2片段分别长850bp，1075bp，721bp（和文中不太一致，但是看图2的电泳图，和我推测的比较一致。）
三者进行PCR融合，构建K1-HY-K2融合片段，长2542bp。末端加A后，连接到pBackZero—T载体上，获得pBackZero-T-RNase LK载体。

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构建pCas-指导RNA(guide RNA，gRNA)载体
使用CRISPR DESIGN程序(http://erispr.mit.edu/)设计针对RNase L基因长度为20nt的gRNA序列。

gRNAG1F:5’-CAATGTTAATTTCCAGGAAG-3’

gRNAG2F:5’-TGACCTGGTCCAGCAATTGC-3’

gRNAG3F:5’-CTCCACCTTCCAGCAATTGC-3’

三条gRNA序列的反向互补链

gRNAG1R:3’-GTTACAATTAAAGGTCCTTC-5’

gRNAG2R:3’-ACTGGACCAGGTCGTTAACG-5’

gRNAG3R:3’-GAGGTGGAAGGTCGTTAACG-5’

一一对应，可以退火形成双链DNA(dsDNA)。

用限制性内切酶BamH I和BsmB I对pCas-Guide载体进行双酶切，胶回收酶切产物。将退火后的gRNA片段和酶切后的pCas—Guide载体片段用T4连接酶进行连接，于37~C反应1 h，将连接后的产物转化大肠杆菌DH5 cx感受态细胞，涂布于含有Amp的LB琼脂糖平板上，37℃孵箱内孵育过夜。用质粒小提试剂盒提取质粒。

为了和粘末端的BamH I/BsmB I酶切后的pCas—Guide载体片段顺利连接，获得新的pCas-指导RNA(guide RNA，gRNA)载体。

寡核苷酸序列设计成以下的序列，退火后正好形成BamH I/BsmB I酶切后的粘末端。

gRNAG1F:5’-GATTCCAATGTTAATTTCCAGGAAGG-3’

gRNAG1R:3’-GGTTACAATTAAAGGTCCTTCCAAAA-5’

gRNAG2F:5’-GATTCTGACCTGGTCCAGCAATTGCG-3’

gRNAG2R:3’-GACTGGACCAGGTCGTTAACGCAAAA-5’

gRNAG3F:5’-GATTCCTCCACCTTCCAGCAATTGCG-3’

gRNAG3R:3’-GGAGGTGGAAGGTCGTTAACGCAAAA-5’

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细胞转染及稳定细胞株筛选
将HEK293细胞接种于6孔板中，待细胞汇合率约达80％时进行转染。
将构建好的载体pBackZero-T-RNase LK(1.5ug)和pCas-gRNA(1ug)共转染HEK293细胞。
转染后第5天，将转染后的HEK293细胞接种到大的细胞培养皿中，待细胞完全贴壁后，加入潮霉素B（300ug/ml）进行筛选。
培养至第十天，肉眼可见单克隆，挑到96孔板中，逐步放大培养。放大培养后的细胞，取10%的细胞保种，余下做WB检测。
一共鉴定35株，5株细胞为RNase L敲除株，阳性率约为15%。
（想知道阴性对照怎么设置的，文中没提及）

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基因组水平上鉴定RNase L敲除的稳定细胞株
RNase I被敲除的细胞株，其基因组中应该能检测到潮霉素B抗性基因插入到的RNase L基因，由此破坏了RNase L编码框，RNase L蛋白不能表达。
以阳性细胞株的基因组为模板，PCR扩增出两段RNase L-潮霉素连接处的融合片段，测序结果和预期一致。
测序结果显示五株细胞的基因组均存在潮霉素基因，RNase L被敲除

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讨论区的知识
RNase L可能参与多种小RNA(sRNA)的加工生成 ，但其分子机制尚不明确。因此构建RNase L基因敲除的细胞株，对深入研究RNase L的生物学功能及分子机制奠定基础。
CRISPR／Cas系统是一项比较新的基因编辑技术，当长度为20mt的小指导RNA（sgRNA）与目位的基因互补配对时， sgRNA介导的Cas9核酸内切酶会募集到该目的基因处并使DNA双链断裂，细胞会以通过非同源末端连接修复和同源重组修复两种方式来修复断裂的双链。非同源末端连接的修复效率高于同源重组修复的效率，但是前者更易出现错配修复，后者更倾向于精确修复。
在CRISPR／Cas系统中，利用同源重组修复机制修复损伤DNA时需要pCas-gRNA和供体DNA两个载体，在设计供体DNA的同源臂时，在一定程度上同源臂越长修复效率越高，插入片段越短同源重组修复的效率越高。

CRISPR／Cas系统相对于锌指、TALEN，设计构建简单，切割效率高 ，几乎能靶向任意细胞的任意基因，能同时靶向多个基因。
但是CRISPR／Cas系统脱靶效率相对较高 ，如果能降低CRISPR／Cas系统脱靶效率，这个技术会更快得以推广。