姜黄素对脑胶质瘤的抑制作用及其机制研究

青龙偃月刀

姜黄素对脑胶质瘤的抑制作用及其机制研究

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目的：研究姜黄素对脑胶质瘤的治疗作用，揭示姜黄素抗脑胶质瘤作用的分子机制。

方法：U251胶质瘤细胞培养和药物处理；药物敏感性试验检测姜黄素抑制胶质瘤细胞体外生长作用；流式细胞术检测细胞周期；DNA梯度凝胶电泳检测细胞凋亡；WB分析蛋白表达；T检验或one-way ANOVA分析统计学差异。

结果：低剂量姜黄素对U251没有明显的生长抑制作用，但高剂量作用下，生长抑制率达35%，与阴性对照相比差异显著。10uM的姜黄素作用24小时后，细胞中ING4蛋白表达水平显著增加，p21和p53蛋白表达明显上调。

结论：研究中发现姜黄素以p53依赖方式诱导脑瘤细胞发生细胞周期阻滞，在此过程中ING4可能通过增加与p53的结合，上调P21，发挥细胞周期阻滞作用。

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主要实验材料
胶质瘤细胞系U251
兔抗人ING4多克隆抗体购自Rockland(Gilbertsville，PA)
姜黄素curcumin购自Sigma(St．LouisMO)；
单克隆抗人caspase-3和腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抗体购自Pharmingen(San Diego，CA)；
鼠单克隆抗人p21和p53抗体购自Santa Cruz(Santa Cruz，CA)；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗

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生长抑制基因家族(inhibitor of growth gene family，ING)是近年发现的新的抑癌家族，包括ING2／INGlL、ING3、ING4和ING5，INC-4能够促使p53乙酰化；抑制细胞生长，并增加细胞对某些DNA损伤药物的敏感性，调节脑瘤肿瘤血管生成。提示INC-4在脑瘤的发病机制中具有重要的作用。

A为正常脑组织，B为U251胶质瘤细胞。
结果可见胶质瘤细胞中INC-4未见有表达。

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加药后ING4的WB检测：
结果显示10uM的姜黄素作用脑胶质细胞24小时后ING4水平显著增加，提示ING4可能参与姜黄素引起的细胞周期阻滞。

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姜黄素对胶质瘤细胞体外生长的抑制作用：
不同浓度的姜黄素处理胶质瘤细胞U251至24h，MTT检测发现:
低剂量姜黄素对U251细胞没有明显的生长抑制作用，但高剂量作用下，生长抑制率达35％。

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姜黄素对细胞周期分布的影响：
FACS检测加药后，胶质瘤细胞U251的细胞周期分布改变。
结果显示低剂量组引起U251细胞G0／G1期细胞轻度减少，G2／M期细胞增加；
高剂量组引起U251细胞G0／G1期细胞明显减少，S期和G2／M期细胞显著增加。
提示姜黄素以引起U251细胞发生S期和G2／M期细胞周期阻滞，并有剂量依赖性，通过引起细胞周期阻滞发挥生长抑制作用。

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姜黄素不诱导胶质瘤细胞凋亡
产生核小体大小的DNA片段是判断细胞凋亡形成的黄金标志，电泳结果显示高剂量组的姜黄素作用细胞24h后，没有形成明显的DNA ladder，提示姜黄素不能诱导细胞凋亡。

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姜黄素上调p21和p53的蛋白表达
Western blot检测姜黄素作用后U251细胞中p21和p53表达水平的改变，结果显示高剂量组中两者均表达明显上调。
提示姜黄素通过p53依赖方式引起胶质瘤细胞发生细胞周期阻滞。

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结论：
① 胶质母细胞瘤中的ING4表达水品和正常脑细胞比较，明显低，和疾病恶性程度呈现负相关关系，提示ING4可能在胶质瘤的发生发展转移中发挥重要作用。
② 姜黄素具有肿瘤抑制功能，能够下调转录因子，抑制细胞黏附分子、趋化因子。诱导细胞凋亡是姜黄素肿瘤抑制作用的重要机制之一。
③ 本研究发现，姜黄素并不明显诱导胶质瘤细胞U251凋亡，而是通过调节肿瘤细胞周期分布，引起S期和G2/M期细胞周期阻滞抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
④ 姜黄素引起的胶质瘤细胞周期过程中，p21和p53的表达显著上调，说明姜黄素以p53依赖方式发挥作用。
ING4基因产物能与p53相互作用，增强p53在转录、凋亡以及DNA修复中的功能。可能机制是姜黄素通过上调ING4，促使ING4与p53的结合，继而引起细胞周期阻滞。