关于纳米抗体的读文献笔记

青龙偃月刀

纳米抗体读文献笔记--不断更新
第2楼：纳米抗体的发现
第3楼：纳米抗体的结构
第4-5楼：纳米抗体和传统抗体结构和功能的区别
第6-10楼：纳米抗体的类型
第11-14楼：纳米抗体的理化和生物学性质
第15楼：纳米抗体的局限性和解决办法
第16-21楼：纳米抗体的筛选方法
第51-53楼：纳米抗体发展史

青龙偃月刀

纳米抗体的发现：
20 世纪90 年代，比利时布鲁塞尔自由大学的Hamers等发现，在骆驼科动物，如单峰驼、双峰驼、美洲驼等的血清中，存在着一种天然缺失了轻链部分，只含有重链部分的重链抗体。
重链抗体在骆驼体内的体液免疫过程中发挥着重要作用，除了缺少轻链部分之外，骆驼体内的重链抗体还缺少CH1区域。
在一些软骨鱼类，如鲨鱼、鳐鱼的体内，发现了与骆驼体内重链抗体结构相似的一种新抗原受体（New antigen receptor，NAR）。
无论是骆驼科动物还是软骨鱼类体内的抗体，虽然仅由重链部分构成，但却仍具有良好和广泛的抗原 结合力，保持了完整的抗体功能。
将骆驼科动物体内重链抗体的可变区基因进行克隆，可以得到一种仅由重链可变区构成的单域抗体，即重链可变区单域抗体（Variable domain of heavy-chain antibody，VHH），又称纳米抗体（Nanobody，Nb）。

青龙偃月刀

纳米抗体的结构与功能：
Nb 体积很小，呈椭圆形， 相对分子质量为15 kD ，仅为普通抗体的十分之一。
使它容易接近靶目标表面的沟、裂缝或被隐藏的抗原表位，识别许多传统抗体无法识别的抗原。
骆驼重链抗体的VHH 和人抗体重链的VH 结构非常相似， 包含三个高变区和其两侧的四个骨架区。
VHH 由两个β片层形成支架，三个高变区聚集在一侧参与抗原识别。
研究VHH的氨基酸排列顺序发现，VHH的CDR1 和CDR3 比VH 的要长，这在一定程度上弥补了轻链缺失造成的抗原结合力下降的不足。
抗原表位常形成凹形拓扑结构，VHH 和传统抗体不同，它的CDR3 形成凸形的结构，能更好的结合抗原，从而提高了VHH 的抗原特异性和亲和力。

青龙偃月刀

纳米抗体和传统抗体结构和功能的区别：
相对于传统抗体，纳米抗体能够具有更好的溶解性、稳定性以及及较好的结合活性。
① 纳米抗体在序列和结构上与人源抗体的重链可变区具有较高的同源性，骨架区（framework regions，FRs）与人VH的同源性更是高达80%，因此具有较低的免疫原性。
② 纳米抗体的FR2 区有4个位点的突变。传统的VH的FR2 区的4个保守性氨基酸（Val37，Gly44，Leu45和Trp47）通过疏水相互作用与VL结合从而稳定Fab结构，在纳米抗体中这些氨基酸则是亲水性更强的氨基酸（Phe/Tyr37，Glu/Gln44，Arg45和 Gly/Phe/Leu47），从而可以在没有VL存在的情况下稳定存在，提高了纳米抗体表面的亲水性，有利于提高纳米抗体的溶解性和稳定性。



③ 纳米抗体的另一个显著特征是具有较长的CDR1区和CDR3区。较长的CDR区域增加了抗体-抗原结合部位的相互作用面积，在一定程度弥补了因缺失的VL对抗体亲和力产生的影响。纳米抗体的CDR3，往往会形成一个凸环结构，而VH-VL的抗原结合区一般是凹形或平面形，因此VHH具有识别一些位于蛋白缝隙或沟槽中的表位的潜力。
④ 相对于传统抗体，纳米抗体的CDR3存在的半胱氨酸与CDR1（在骆驼上比较常见）或CDR2（在美洲驼上比较常见）之间的半胱氨酸往往会多形成一对二硫键，从而进一步稳定抗原结合区的构象，增强纳米抗体对于温度的耐受性。

青龙偃月刀

大分子单抗缺点：
组织（如实体瘤）穿透能力差、生产和储存成本高、价格昂贵，促使研究人员对抗体分子进行基因工程改造，如小型化（Fab、ScFv 以及Nanobody）或发展基于新的结构骨架的抗体类似物或模拟物。
大分子抗体的导向疗法尚存在着较大的困难：
(1) 抗体在机体免疫原性大：鼠源抗体，常会诱导人抗鼠抗体的免疫应答；
(2) 难以获得所需特异性的免疫球蛋白的特定亚类：完整的大分子抗体不一定能到达作用部位．抗体恒定区的其他功能会引起一些不良反应；
(3) 人的杂交瘤制备较为困难．直接用人的单克隆抗体治疗疾病尚难开展。

青龙偃月刀

纳米抗体的形式--单价纳米抗体　
从免疫或非免疫骆驼体内分离出重链抗体, 克隆其可变区可得到含有多种单价Nb 的抗体库。
用特异性抗原从Nb 库中筛选, 可得到抗原特异的纳米抗体。
Nb具有严格的单体结构, 能防止蛋白聚集，一些Nb 甚至能清除已形成的聚集体。
而且Nb 能在细胞内表达，成为细胞内抗体发挥作用。因此可以考虑使用Nb 治疗淀粉样变疾病, 如阿尔茨海默病、帕金森病和眼咽型肌营养不良症。
Nb 表面有大量的亲水残基， 能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性高亲和力地与其抗原相结合。
Nb能与细菌或病毒表面特异的抗原结合, 中和或封闭这些抗原, 起到一定的治疗作用。

青龙偃月刀

纳米抗体的形式--双价纳米抗体　
双价抗体是在单链抗体的基础上构建而得，具有两个相同的结合位点。
在小鼠关节炎模型中，双价的抗肿瘤坏死因子Nb 分子的效果要比单价的分子高500 倍 。
卡普赛珠单抗（Caplacizumab）即一个双价纳米抗体。

青龙偃月刀

多价和多特异性纳米抗体：　
Nb 只有一个结构域, 溶解性和稳定性较好, 是理想的多价和多特异性抗体的构建单元。
多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和力；多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。
Nb结构简单，可通过短小的连接序列(linker) 聚合在一起，转换成多价和多特异性的形式。

青龙偃月刀

双特异性抗体:
是一种可以结合两个或者一个抗原的两个表位的一种人工抗体。
在肿瘤免疫治疗中，一个分子结合到外来的或恶性的细胞，另一个分子结合体内的效应分子或免疫细胞。通过募集细胞至肿瘤细胞周围，靶向地攻击前者，通过ADCC/CDC效应，导致细胞死亡，是一种高效的免疫治疗方法。
目前已经分离出抗FcγRIII (CD16) 的Nb , 这种Nb 能活化自然杀伤细胞, 起到抗肿瘤的作用 。

青龙偃月刀

纳米抗体存在体内易被快速清除，半衰期短的劣势。
目前在研的治疗类单域抗体往往采用多特异性分子联结、结构修饰或者融合蛋白的设计策略来延长体内半衰期，拓展特异性。

“融合”的纳米抗体　
Nb具有严格的单体特点和15kD的大小, 很容易通过基因工程技术与其他结构结合形成新的融合分子, 如能延长其半衰期的物质、酶、抗菌肽或显影物质等。
在新的融合分子中, Nb与其靶抗原定向结合, 与Nb 融合的部分就能发挥相应的功能。