VEGF（血管内皮生长因子）的纳米抗体

青龙偃月刀

20007
Inhibition of angiogenesis in human endothelial cell using VEGF specific nanobody

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摘要：
血管生成在肿瘤的生成和转移过程中的重要一步。VEGF生长因子在血管生成的进展中发挥重要作用，VEGF121和VEGF165是VEGF家族的两个形式，具有整个分子的生物学活性。
本研究通过免疫骆驼，筛选到4个VEGF的纳米抗体Nb22, Nb23, Nb35，Nb42，加HIS标签进行表达纯化。
四个抗体和VEGF的亲和力为0.1到60nM。
这些抗体能有效抑制内皮细胞增殖或者血管生成。

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背景资料：
血管生成是机体的常见现象，生理情况下如胚胎发育，女性子宫内膜周期性变化，伤口愈合等；在病理情况下，如类风湿性关节炎、糖尿病的视网膜病、创伤修复、肿瘤的生长与转移等。
肿瘤的血管新生是其获取营养、代谢的形态学基础，也是肿瘤细胞迁移、游走及转移的必然环节。
1980年，Folkman等人提出抑制血管生成可能对癌症的治疗有效的理论。
VEGF-A在很多实体瘤内过表达，和内皮细胞上的受体VEGFR1 (Flt-1)以及VEGFR2 (Flk-1/KDR)结合。
VEGF-A基因含8个外显子，经过不同的剪切，形成主要物种主要的异构体形式 (VEGF121, VEGF145,VEGF165, VEGF189以及VEGF206). VEGF121和VEGF165是最主要的两种异构体，含121和165个氨基酸。
AVASTIN和Ranibizumab是针对VEGF-A的两种商品化单抗。单抗存在一些使用上的缺陷：如刺激产生免疫应答，不能解除实体瘤的隐藏区域等。
纳米抗体的生物物理特性和药理学特性对其成为更合适的药物分子。
本文针对VEGF-A筛选到几株纳米抗体。

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实验材料：
人脐静脉内皮原代细胞 （贴壁细胞），EBM-2培养基中进行培养。
纯化的VEGF121蛋白和VEGFR2的胞外区蛋白。
商品化的VEGF121和VEGF165蛋白。
Avastin单抗
pHEN-4噬菌粒载体，融合蛋白带HA标签。
pHEN-6C是原核表达载体，表达纳米抗体蛋白，C端含His标签。

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骆驼免疫：
雄性成年骆驼，皮下多点注射VEGF121抗原，每周间隔免疫一次，一共免疫六次。
首次免疫用量为200ug蛋白，溶解于2mlPBS中，加等量完全氟氏佐剂。
加强免疫用量同首次免疫，区别在于加不完全氟氏佐剂。

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噬菌体文库构建：
末次免疫后一周，取150ml的骆驼血样，加入到抗凝管中，分离淋巴细胞。
提取总RNA，反式互补获得cDNA。
巢式PCR获得VHH基因，
第一轮PCR中
使用引物CALL001 (5-GTCCTGGCTGCTCTT CTACAAGG-3)
和CALL002 (5-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3).
胶回收纯化重链抗体的VHH-CH2片段，大约600-700bp。
第二轮PCR中
使用引物A6E (5-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3)
和38 (5-GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3).
扩增得到的片段用PstI和NotI酶双切，连接到 pHEN-4载体中，转化TG1细菌。
用辅助噬菌体VCSM13协助呈现。

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纳米抗体库的淘选：
以VEGF12作为抗原，进行4轮的筛选。库的用量为10^7个转化子。
包被抗原逐轮降低，洗涤条件逐渐严苛，PBST的TWEEN含量逐渐增加（0.5，1，2，4%）

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比较实验孔（包被VEGF121)和对照孔(包被BSA）不同轮次筛选的噬菌体产出比：

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从第三轮，第四轮筛选过程中产生的克隆中随机挑选90来个放大培养，IPTG诱导纳米抗体基因的表达，对蛋白进行周质提取物的ELISA检测。其中10个克隆和VEGF121特异性反应，其中4个克隆Nb22, Nb23, Nb35，Nb42，信号最强。

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对四株纳米抗体进行测序，用MEGA-5程序进行序列分析，符合VHH的序列特征。
将四株抗体序列亚克隆到pHEN-6C表达载体中，转化WK6细菌。
利用HIS标签，进行镍柱纯化，PBS液中进行置换。运用VIVASPIN超滤管进行蛋白的浓缩。
SDS-PAGE进行电泳，WB检测蛋白（二抗为HRP-抗HIS二抗）