A novel bispecific antibody, BiSS, with potent anticancer activities

青龙偃月刀

A novel bispecific antibody, BiSS, with potent anticancer activities
发表于cancer biology & therapy（2019年 IF=3.569)

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双特异性抗体的研发是当前抗体药物研发的热点领域之一。
针对肿瘤的双特异抗体可以结合两个靶向位点，一个是肿瘤细胞表面的肿瘤抗原，另一个是免疫细胞表面的抗原。BsAbs 同时结合T 细胞表面的抗原和肿瘤抗原，使肿瘤细胞和T 细胞紧密连接起来，所以它能让T 细胞迅速募集于肿瘤组织处并对其进行有效消除。
这篇文章中，将两个单域抗体组成一个双特异抗体。
其中一个抗体针对CEA癌胚抗原。
另一个抗体针对CD16分子，募集NK细胞。
异种移植模型中，可以看到双特异抗体能阻碍癌症进程。

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文中构建的双特异抗体
一个分子为抗癌胚抗原的单域抗体(序列来自GenBank: ABS29544.1)
一个为抗CD16抗体(序列来自GenBank: ABQ52436.1)
通过3个GGGGS进行连接。
在双抗分子C末端加上一个HIS标签，N末端加上一个DsbA序列，促进蛋白分泌到周质中。

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双特异性抗体在周质表达，经过镍柱，Q柱纯化后，得到纯度较好的蛋白，浓度达到0.5mg/L。凝胶过滤层析分离蛋白，在28kda能看到很单一的峰，和双抗大小预期一致。
说明蛋白主要以单体形式出现，没有聚集。

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实验中用到的细胞：
人卵巢癌细胞系SKOV-3（CEA表达阴性）, 人结肠癌细胞系LS174T和HT-29（CEA表达阳性）
人NK细胞，用EasySep Human NK Cell Enrichment Kit从人PBMCs中分离而得

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BiSS双抗识别表达CEA抗原的细胞


流式监测到双抗能识别LS174T细胞，和HT29细胞有微弱识别，SKOV3细胞没有识别信号
WB检测和流式结果一致，其中SKOV3/CEA是瞬时表达CEA的SKOV3细胞系。

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细胞杀伤实验
评价双特异性克隆能否启动癌症细胞死亡，
对SKOV3细胞没有作用，
对于HT29细胞，随着双抗浓度的提高，能诱导细胞的杀伤作用。
LS174细胞，双抗浓度低至10^-3，也能诱导细胞的杀伤作用。
而没有双抗存在的情况或者没有NK细胞的存在下，对细胞没有杀伤作用。
进一步用更多的浓度梯度，评价双抗对LS174和HT29细胞的杀伤抑制作用。和预期一致。

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可溶性CEA竞争实验

对于癌症患者，CEA能从癌细胞释放到血中，因此双抗和血液中的可溶性CEA结合，竞争性抑制双抗和癌细胞表面上的CEA结合。
结肠癌患者血清中的CEA浓度为 4.2–102 ng/ml(0.023-0.56nM)
将0.01nM的双抗和不同浓度的CEA进行孵育（0.028 nM, 0.28 nM，2.8 nM）
通过竞争实验可以观察到，只有高浓度的可溶性CEA能抑制双抗和癌细胞的结合，从而影响到NK细胞对癌症的细胞杀伤作用。
由此可见，患者体内的CEA浓度不足以影响到双抗介导的NK对癌症细胞杀伤作用。

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双抗对体内的肿瘤抑制作用
LS174T 细胞和人PMMCs混合后皮下注射NOD-SCID小鼠建荷瘤模型。
用双抗进行处理后，可以观察到肿瘤生长明显受到抑制。
三组小鼠（每组5只）
LS174T 细胞单独注射组，LS174T 细胞和人PMMCs混合注射组，小鼠全部长出肿瘤。
加入双抗处理组，每日加20ug双抗/每只，五只小鼠有四只肿瘤得到有效抑制。

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讨论部分：
癌症的免疫治疗，是近些年兴起的一种治疗手段。

第一个FDA批准上市的双抗博纳吐单抗采用了BITE技术，将两个ScFv进行串联表达，这种抗体稳定性不够，容易聚集。在原核系统中不容易表达，

本研究中，将两个单域抗体VHH融合成双特异抗体，在原核中获得高效表达，稳定性和可溶性均好。
两个VHH抗体一个是针对癌症细胞上的CEA抗原，一个是针对NK细胞上的CD16分子，体外实验显示，低剂量的双抗即可介导NK对CEA阳性肿瘤细胞HT29和LS174T细胞的杀伤作用。
早前有针对这两个靶点的FAB样双特异性抗体，数据也不是很成熟，纳米双抗可以和其进行比较。