CD7 纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7 阳性急性髓系白血病细胞的杀伤活性

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CD7 纳米抗体衍生的CAR-T细胞对CD7 阳性急性髓系白血病细胞的杀伤活性

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摘要：
目的：针对CD7 阳性的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞开发一种新型的CD7 嵌合抗原受体修饰的T细胞（CD7-CAR-T），观察其对CD7 阳性AML细胞的杀伤作用。
方法：基于CD7 纳米抗体序列、CD28 和4-1BB共刺激域序列构建CD7-CAR慢病毒载体，包装病毒颗粒并与CD7 蛋白阻断剂（protein expression blocker，PEBL）慢病毒共感染人T细胞，制备CD7-CAR-T；应用实时无标记动态细胞分析技术（real time cellular analysis，RTCA）验证CD7-CAR-T 对CD7 过表达的293T细胞的特异性杀伤能力，流式细胞术检测CD7-CAR-T 对CD7 高、中、低表达的AML细胞（KG-1、HEL、Kasumi-1 细胞）的增殖和细胞因子分泌的影响。
结果：成功构建CD7-CAR-T 细胞并阻断其表面CD7 的表达，与T 细胞相比，CD7-CAR-T 细胞可以抑制CD7-293T 细胞的增殖并促进其分泌TNF、Granzyme B 和INF-γ ，可显著促进CD7 阳性的KG-1 细胞和HEL细胞的凋亡（t=147.1、P＜0.01；t=23.57、P＜0.01）和细胞因子分泌（P＜0.05 或P＜0.01），而对低表达CD7 的Kasumi-1 细胞无显著影响（t=0.7058、P＞0.05）。
结论：CD7-CAR-T细胞能够特异性杀伤CD7阳性的AML细胞。

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嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞（chimeric antigen receptor gene modified-T lymphocytes，CAR-T）技术是近年来发展非常迅速的免疫治疗方法，其中CAR的分子结构主要包括胞外抗原结合区和胞内共刺激区。
目前AML急性髓系白血病 的CAR-T 治疗中多以CD123 和CD33 为靶点，但取得疗效的同时也伴随着较大的骨髓毒性。
本文选用CD7作为靶点。
CD7 是一种穿膜糖蛋白，其阳性患者占AML的30%左右。
CD7 的正常表达主要局限于T 细胞和NK 细胞及其前体，粒细胞和成熟B 淋巴细胞不表达。
CD7 阳性的AML患者的总生存率和无病生存率明显低于CD7 阴性患者，CD7 阳性的AML的临床特征已逐渐成为一个独特的AML类别。

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实验材料：
KG-1 和Kasumi-1 细胞系，HEL、AML5、HL-60 及THP-1 细胞系。
CD3/CD28 磁珠、Fc 抗体、Cytometric Bead Array（CBA）System 相关试剂盒
Human Granzyme B、Human TNF、Human IL-2、Human IFN-γ 细胞因子试剂盒
凋亡试剂盒Annexin VAPC/7-AAD Apoptosis Kit
羧荧光素琥珀酸亚胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE）

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分离T细胞，加入CD3/CD28磁珠激活T细胞。添加IL-7和IL-15培养基进行培养。
T细胞激活48小时后，进行CD7-CAR病毒转染，进行细胞放大培养。
CD7-CAR载体包括纳米抗体CD7序列，人FC序列，共刺激分子D28，4-1BB序列和CD3δ序列。
蛋白阻断剂（PEBL）载体结构包括anti-CD7纳米抗体和内质网滞留序列。

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流式细胞术检测AML细胞表面CD7 的表达显示，KG-1 细胞表面CD7 表达率为97.61%（图1A）
HEL细胞表面CD7表达率为69.32%（图1B）
THP-1 细胞表面CD7 表达率为3.36%（图1C）
HL-60 细胞表面CD7 表达率为1.19%（图1D）
AML5 细胞表面CD7 表达率为0.50%（图1E）
Kasumi-1 细胞表面CD7 表达率为0.17%（图1F）
因此选择KG-1、HEL 和Kasumi-1 细胞（CD7高、中、低表达）进行后期实验。

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构建CD7-CAR-T 细胞并阻断其表面CD7的表达