肉毒毒素A的纳米抗体

青花瓷

Camelid VHHs Fused to Human Fc Fragments Provide Long Term Protection Against Botulinum Neurotoxin A in Mice

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摘要:
肉毒杆菌分泌的肉毒毒素对神经系统有破坏作用。
通过免疫骆驼，建库，筛选得到15株抗肉毒毒素的VHH抗体。
加有人Fc片段的VHH抗体在小鼠血液中存在时间延长至14天。
和单个VHH相比较，5LD50攻击，VHH-FC保护小鼠活性提高1000倍。
抗体免疫后14天，依然保留有保护活性，说明VHH-fc具有有效的抗毒素保护作用。

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肉毒毒素中毒机理：在体内肉毒毒素特异性的与胆碱能神经末梢突触前膜的表面受体相结合，内化（internalization），阻抑了胆碱能神经介质——乙酰胆碱的释放。与此同时，毒素与突触前膜结合，还阻塞了神经细胞膜的钙离子通道，从而干扰了细胞外钙离子进入神经细胞内以触发胞吐和释放乙酰胆碱的能力。乙酰胆碱释放的抑制，有效地阻断了胆碱能神经传导的生理功能，尤其是神经一肌肉接头部位特别敏感，引起全身随意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。

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肉毒毒素是目前是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强烈的生物毒素，它主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，对人的致死剂量约为10ng/KG。
自然界常见的肉毒来自食物，伤口，婴儿也容易被感染。
根据毒素抗原性的不同,将其分为A、B、C、D、E、F和G7个型。其中A、B、E、F为人中毒型别。根据WHO推荐，一旦确诊为肉毒中毒，尽快使用马血清来源的抗毒素进行注射治疗。
但是，马血清抗毒素也存在有过敏反应和血清病的危险，婴儿中不推荐使用。
类毒素也曾经用于肉毒高危人群的预防，但是效力持续下降，所以不再使用。
肉毒中毒后对生命威胁最大的是呼吸功能的损害及其并发症。患者都应该住院治疗，准备随时进行气管插管及机械性通气。

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肉毒单抗是替代马血清进行预防和治疗的一个手段。
单域抗体也可以用于研制肉毒单抗，并且优势明显。
VHH现在用于抗病毒感染和毒素，如来自植物和微生物的蓖麻，人支原体，破伤风梭菌，难辨梭状芽胞杆菌、杜氏禾谷杆菌和产志贺毒素大肠杆菌等抗毒素的研究中。

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同时，VHH的优势也在另一方面造成障碍。
体积小，渗透性好，分布迅速，但是在血液循环中的半衰期短，限制了与难以到达的表位相互作用的时间，并限制了足够量的抗体通过血管内皮屏障的时间。不过，通过基因工程可以对抗体结构进行改造，获得期望的特性，比如延长半衰期。
一种方法是在VHH的C末端加入白蛋白结合肽，使VHH的血清半衰期增加到1-2天。
另一种方法是构建串联一个或者多个VHH蛋白，融合到编码红细胞糖蛋白A或Kell。
体外研究和干细胞移植研究表明，这些VHH的半衰期能延长到几周，VHH也可以融合到IgG的FC区。
增加了蛋白复合物大小，VHH-Fc与新生儿Fc受体（FcRn）的相互作用，使得肾脏过滤系统无法清除抗体。
此外，Fc片段可以促进效应细胞功能，如吞噬和细胞毒性，从而提高病原体进入和复制的中和作用。

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实验动物：
4岁雌性健康羊驼，6周龄Balb/c小鼠 (18–20 g)
抗原制备：
抗原来自A98株肉毒杆菌的BoNT/A，加入甲醛处理，制备成为含少量HA的BoNT/A类毒素。免疫羊驼前先在小鼠体内检测残余毒性，调整浓度为60ug/ml。
羊驼免疫：
先后免疫5次，首次和第二次之间周期为14天，后几次免疫间隔10天，首次剂量60ug（溶于1ml），后四次免疫抗原用量为90ug。
免疫前以及第3次，第5次免疫后采血5-7ml。检测血清中有效抗体滴度。最后一次免疫后第五天，采血50ml，用于建库。

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免疫羊驼后第24天和49天，分别采血进行抗体特异性检测五免后能达到 1/600,000 。

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噬菌体抗体库的构建
库的构建选用pHEN1作为噬菌体表达载体，利用Not I和Sfi I将纳米抗体库基因插入到载体中。
引物序列如下，常规构建。

库容量约为5×10^6 。

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筛选：
BoNT/A-DTT ：抗原BoNT/A 用1mM DTT进行处理， 25 °C作用30分钟。加DTT后，毒素能还原成为重链和轻链两个分子。
ELISA板上加5 μg  BoNT/A 进行第一轮筛选，BoNT/A-DTT或者BoNT/A 分别用于进行第二轮筛选。