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青龙偃月刀

4-1BB 纳米抗体

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41BB，又称为CD137，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种可诱导的细胞表面受体，广泛表达于激活后的T细胞、Tregs、NK细胞、单核细胞、DCs，以及肿瘤内皮细胞。41-BB的配体是CD137L，也属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要表达于激活后的抗原呈递细胞。
CD137/CD137L结合，形成三聚体，募集TRAF-1/2 signaling adaptors，从而激活NF-κB信号通路。CD137信号转导可以激活NK细胞，促进T细胞增殖并产生抗肿瘤活性。基于目前研究数据，CD137的活化可以诱导T细胞和NK细胞活化，并产生持久的记忆应答。

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癌症免疫治疗的最终目标就是激活免疫反应杀死肿瘤细胞。
这些免疫系统反应通常需要诱导炎症反应，并且诱导激活信号又需要受到抑制防止引发诱导过度的炎症。

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实验动物：
人 PD-L1/PD-1/4-1BB三基因敲入小鼠
人PD-L1/4-1BB双基因敲入小鼠
人4-1BB基因敲入小鼠

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所用细胞：
整合有人PD-L1基因的CT-26和MC-38细胞
CHO细胞
人PD-L1和人4-1BB过表达的CHO细胞
慢病毒感染表达载体后表达报告蛋白NF-κB荧光素酶和4-1BB蛋白的 Jurkat 细胞

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所用抗体
Urelumab 序列来自于专利 US8137667B2Urelumab（BMS-663513）是一种全人的IgG4 mAb，是第一个进入临床试验的抗4-1BB治疗药物。
Utomilumab 序列来自于专利US2012/0237498A1
Utomilumab（PF-05082566）是人源化IgG2单克隆抗体，其激活4-1BB，同时阻断与内源性4-1BBL的结合。
构建轻重链真核表达载体，ExpiCHO 系统进行抗体的表达

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羊驼免疫和库的构建
第0，14，28，42天分别皮下注射500ug重组人PD-L1蛋白(ACRO Biosystems) 或者4-1BB蛋白(ACRO Biosystems) 。
末次免疫后第7天采血，收集PBMC细胞。
提取RNA，反转录获得cDNA，建VHH抗体库，骨架载体为酵母质粒pFabVH。
pFab载体系统呈现的融合蛋白为vHH-Aga2p-Myc标签。

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酵母展示技术筛选纳米抗体纳米抗体表达VHH的酵母菌在 G/RCAA培养中进行培养，通过MACS和4次FACS分选阳性酵母菌，测序。

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酵母展示文库：纳米抗体的C端融合了一个HA标签，在与荧光标记的HA抗体孵育的情况下，可用于检测酵母细胞中纳米抗体的表达情况。
HA标签C端则融合一个长铰链区连接到酵母细胞表面实现有效的展示(McMahon等，2018)。
其次，展示库中含有约5 × 108种纳米抗体序列。
在实际操作中，因为文库数量巨大，一般先采用磁珠分选的方法对能结合靶蛋白的酵母进行富集，然后再采用更精确的荧光流式分选进行进一步富集。
流式荧光分选时，荧光信号一般来自于靶蛋白质上的化学标记。

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蛋白表达和纯化：合成PD-L1（19-134位）基因，C末端加入6his的融合蛋白标签T，插入到pET21b构建原核表达载体。
vHH HZ-C-Ye-18纳米抗体基因和人IgG1-FC端进行融合，插入到pcDNA3.1构建真核表达载体。
ExpiCHO表达细胞用于表达VHH抗体，用Protein A进行纯化，纯化后的vHH用IdeS进行酶切处理，用Protein G进行纯化，去除Fc段。再用GingisKHAN对vHH蛋白进行酶切，获得HZ-C-Ye-18. 4-1BB (25-162) 。同样的方法制备得到另一株纳米抗体HZ-L-Yr-16
However, a truncated Fc with only Leu-Gly-Gly in the hinge region was cloned into the vector.23 The encoded plasmid was transiently transfected into Expi293 cells (Life technologies) using polyethylenimine (PEI). For 4-1BB, the eluted protein was concentrated, cleaved by IdeS and purified by a Protein A column. The 4-1BB monomer was separated from 4-1BB homodimer using on a Superdex 75 Increase 10/300 GL column. For HZ-LYr-16, only one step purification was performed using a Protein G column after IdeS cleavage.