Identification and characterization of a neutralizing monoclonal antibody

青花瓷 · 发表于 2021-9-20 09:38:03

Identification and characterization of aneutralizing monoclonal antibody thatprovides complete protection against Yersiniapestis

青花瓷 · 发表于 2021-9-20 10:12:39

本帖最后由青花瓷于 2021-9-22 20:25 编辑

本文描述了通过杂交瘤技术获得的抗鼠疫单抗。其中有一个新的小鼠单克隆抗体（F2H5），该抗体在预防性给Balb/c小鼠（静脉注射100μg）时对鼠疫杆菌141感染具有完全保护。
将F2H5人源化，鉴定其与鼠疫杆菌F1蛋白结合的能力，并使用计算和实验方法进一步鉴定中和表位。
westernblot结果表明是一个线性表位，但使用ELISA的肽图谱未能识别表位，说明是一个构象表位。
我们采用计算机计算方法来预测抗原-抗体相互作用的位点，认为F1中的残基G104E105N106对F2H5结合至关重要，并且是和F2H5的CDRH2和CDRH3相互作用。

青花瓷 · 发表于 2021-9-21 00:36:47

致病性鼠疫杆菌的培养
青海省地方病防治研究所从青藏高原喜马拉雅旱獭中分离出一株致病性鼠疫杆菌（141毒株）。鼠疫杆菌141（样本ID:11001）皮下注射BALB/c小鼠时，其半数致死剂量（MLD）为17个菌落形成单位（CFU）。鼠疫杆菌在28℃的LB培养基中培养18小时，然后通过Maxwell比浊法定量，用PBS稀释。稀释液中的鼠疫杆菌数量通过培养鼠疫杆菌选择性琼脂培养基上的菌落形成单位（CFU）进行定量。

青花瓷 · 发表于 2021-9-21 00:54:54

本帖最后由青花瓷于 2021-9-21 01:05 编辑

野生型和突变型F1蛋白的表达
F1蛋白基因插入到 pET-32a (+) 载体中，表达蛋白为包涵体表达，需要进行尿素变性复性。
突变型F蛋白也是包涵体表达。

青花瓷 · 发表于 2021-9-21 01:05:36

杂交瘤技术筛选得到针对F蛋白的单抗
常规杂交瘤技术筛选到4株抗F蛋白的单抗 F2H5, F5C10, F6E5, F12H4
对四株抗体进行动物保护实验，动物选择6–10周龄的BALB/c小鼠(n = 5/组)
每只小鼠静脉注射接种100ug纯化的抗体，对照组注射PBS。
24小时后腹腔注射600cfu（≈35LD50)的141强毒菌株进行攻击

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-22 16:09:17

所有的生存实验都是在青海省地方病防治研究所的生物安全实验室进行的。

青花瓷 · 发表于 2021-9-22 19:14:29

黄帮主的小跟班发表于 2021-9-22 16:09
所有的生存实验都是在青海省地方病防治研究所的生物安全实验室进行的。

你不服啊？

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 09:28:04

F2H5的人源化和表达
F2H5 重链和轻链的可变区域分别通过重叠 PCR 与人 IgG1 重链和k 轻链的恒定区域相连。然后将人源化抗体的重链和轻链克隆成pCDNA3.4载体。表达重链和轻链的质粒转染 HEK293FT 细胞中。
ELISA检测结合活性 （可借鉴elisa英文实验步骤）
WB检测
基于肽的elisa
计算建模 用于预测抗原-抗体复合物的界面 F2H5 突变体和 F1 突变体增加亲和力
表达纯化突变体

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 09:30:32

结果
elisa筛选出4种mab，尾静脉注射100ug的抗体和24小时后用600CFU的鼠疫菌141株攻击。其中三种抗体（F5C10 [60%];F6E5 [60%]和 F2H5 [100%]提供了一定程度的保护

黄帮主的小跟班 · 发表于 2021-9-23 09:59:20

本帖最后由黄帮主的小跟班于 2021-9-23 10:00 编辑

elisa检测rF1抗原识别表位
检测出27种覆盖F1抗原全长的肽

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