Safety and Efficacy of RNAi Therapy for Transthyretin Amyloidosis

青龙偃月刀

Safety and Efficacy of RNAi Therapy for Transthyretin Amyloidosis
2018年8月11日，在RNAi现象被发现20周年之际，首例RNAi药物patisiran通过FDA审批，获准上市！
该疗法由RNAi 治疗技术的最牛公司 Alnylam Pharmaceuticals，Inc.研发。
是RNAi这一诺贝尔奖成果从概念走向临床治疗的一个重要里程碑！

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摘要：
背景：甲状腺转运蛋白淀粉样病变是肝源性淀粉样甲状腺转运蛋白在外周神经和心脏沉积所致。一种RNA干扰（RNAi）介导的治疗方法可能减少甲状腺转运蛋白的产生。
方法：本研究中对两种针对抗甲状腺转运蛋白的小干扰RNA，分别进行单剂量，安慰剂对照的I期临床实验，从甲状腺转运蛋白水平的安全性和效果进行评价。两种制剂ALN-TTR01和ALN-TTR02的区别在于使用两代脂质纳米颗粒对小RNA进行包被。首先评估ALN-TTR01（剂量为0.01-1.0 mg/公斤体重）对于32例转甲状腺蛋白淀粉样变病人的作用，进一步评估ALN-TTR02（剂量为0.01-0.5 mg/公斤体重）对于17例健康志愿者的作用。
结果：两项试验中均观察到甲状腺转运蛋白呈快速、剂量相关、持续性降低。ALN-TTR01（剂量组为1.0 mg/公斤体重）能抑制甲状腺转运蛋白，在第7天蛋白表达水平降低38%，与安慰剂组比有显著性差异（P=0.01），突变和非突变型甲状腺转运蛋白下降水平相似。ALN-TTR02（剂量组为0.15和0.3 mg/公斤体重)甲状腺转运蛋白表达水平最大达到82.3以及86.8%，两组在第28天蛋白表达水平分别降低为56.6以及67.1%（和安慰剂组进行比较，所有P<0.001）。此外，在20.8%ALN-TTR01受试者和7.7%ALN-TTR02受试者中，有轻中度副作用。
结论: ALN-TTR01和ALN-TTR02能抑制突变型和非突变型甲状腺转运蛋白的产生，为针对致病基因转录的信使RNA进行靶向RNAi治疗提供证据。（Alnylam Pharmaceuticals项目，ClinicalTrials.gov号为NCT01148953和NCT01559077。）

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背景资料：
甲状腺转运蛋白是致死性疾病，肝源性的甲状腺转运蛋白能在很多器官和组织中沉积。
除了肝脏外，视网膜和脉络丛也能生成甲状腺转运蛋白，也能形成在玻璃体和软脑膜的蛋白沉积。沉积的淀粉样蛋白有突变型蛋白，也有非突变性蛋白。
TTR基因上有100多处突变位点和遗传性甲状腺转运蛋白淀粉样变性疾病有关。最为常见的突变位点有V30M，和甲状腺转运蛋白淀粉样变性多发性神经病变有关。
除了神经病变外，TTR基因突变还可以引起多发性心肌病变，如V122I突变。
肝移植是目前针对该疾病的常见治疗手段，但是受到肝源，高致死率等很多限制，并且对眼部和中枢神经系统来源的蛋白沉积不起作用。
辉瑞公司的小分子药物Tafamidis选择性地结合TTR四聚体的特定位点，防止因其去稳定化而引起的ATTR-CM淀粉样蛋白的形成，可以用于该疾病的治疗。
2012年，该药在欧盟和美国取得孤儿药资格。（备注：2017年5月和2018年3月，FDA为tafamidis颁发了快速通道资格和突破性疗法认定。2018年3月，日本厚生劳动省也为tafamidis颁发了先驱资格）

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RNA interference (RNAi)技术机制：（摘选自百度）

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA，细胞对这些dsRNA迅即产生反应。
胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。
siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。
RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部分切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。
被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。
需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

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本研究中使用到的siRNA两种制剂ALN-TTR01和ALN-TTR02的区别在于使用两代脂质纳米颗粒对同一种小RNA进行包被。
制剂经过静脉注射后，被载脂蛋白识别结合(1)
在血液循环中，制剂通过和肝细胞表面的载脂蛋白受体结合进入肝细胞 (2)
通过内吞作用，形成内囊泡(3)
阳性的LNP和阴性内质膜结合，小RNA被释放进入胞质(4)
形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)(5)
双链RNA解链，结合在RISC上的反义RNA识别突变型/野生型TTR mRNA的3-UTR区(6)
RISC中的Argonaute 2蛋白介导mRNA切割(7)
导致突变型/野生型TTRmRNA基因抑制，TTR蛋白表达降低(8)

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受试对象
ALN-TTR01组纳入标准
年龄>18岁
经活检证实的轻度至中度的甲状腺转运蛋白淀粉样变多发性神经病变。
卡诺夫斯基指数得分超过60
BMI在18.5-33之间
纽约心脏病协会分级为II级或者更低级别，肝，肾，甲状腺功能正常。
ALN-TTR02组纳入标准
年龄在18-45之间健康人群（根据病史，体检，十二导联心电图结果而定）
BMI在18-31.5之间
肝功，血常规正常，不在育龄期（实际入组的受试者全为男性）
另外，入组的V30M突变患者没有接受过tafamidis治疗。
在研究起点，检测两组的血清中甲状腺素转运蛋白含量，ALN-TTR01组患者略低于ALN-TTR02组健康人，和以往报道一致。

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非人灵长类实验结果：
人类和非人灵长类食蟹猴的TTR基因在 3-UTR区完全一致，所以ALN-TTR01和ALN-TTR02制剂中的siRNA同样对食蟹猴TTR基因有基因抑制作用。
ALN-TTR01单剂量1.0mg/公斤体重组在注射后第7天对TTR能有50%的基因抑制作用，第28天恢复到原基础水平。
ALN-TTR02单剂量0.1mg/公斤体重组在注射后第7天对TTR有75%的基因抑制作用。
ALN-TTR02单剂量0.3mg/公斤体重组在注射后第14天对TTR有90%的基因抑制作用，在第28天依然有70%的抑制作用。
进一步用ALN-TTR02单次0.3mg/公斤体重的剂量多次注射食蟹猴，每四周一次，一共五次。
每次注射后对TTR的基因抑制动力学分析比较一致，第一次注射后抑制率达到85%，第五次注射后抑制率能达到94%。（由图可见：图B和图A有些矛盾处，A图的ALN-TTR02单剂量0.3mg/公斤体重组在第28天依然有70%的抑制作用。而B图在28天时基因抑制率不到50%）

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实验设计：
ALN-TTR01组招募人群，2010.07-2011.09期间选取，ALN-TTR02组招募人群，2012.03-2012.05期间选取。两组I期临床实验均为多中心，随机，单盲，安慰剂对照，剂量范围研究，评价单剂量ALN-TTR01和ALN-TTR02的安全性和有效性。
ALN-TTR01组按剂量0.01-1.0 mg/公斤体重以及安慰剂（生理盐水）分8个组别，每组4人（此处和FIG1A 描述不同）。ALN-TTR02组按剂量0.01-0.5 mg/公斤体重以及安慰剂
静脉注射各制剂。
ALN-TTR01组结果：
A:和安慰剂相比较，0.01-0.7mg/KG体重的剂量组六个组和安慰剂组比较，对TTR的基因抑制作用无显著性差异。
1mg/kg体重的剂量组在第一天即能有明显的基因抑制作用，在第7天能达到38%的基因抑制作用。
B:1mg/kg体重的剂量组的六名受试者，TTR突变位点有所不同，对TTR的基因抑制作用互不相同（由Fig1A和B可见，这个剂量组的受试者有六人，文中却写得是In the group receiving 1.0 mg per kilogram, which included two series of four participants each。每组4人，共8人？）,ALN-TTR01对S77F这个患者的基因抑制作用最好，第二天能达到50%，第10天到81%，28天依旧能保持50%的抑制率，第70天依旧有基因抑制作用。
C： 甲状腺转运蛋白的主要功能能和视黄醇结合蛋白结合，因此甲状腺转运蛋白受到基因抑制后，血清中的视黄醇蛋白和维生素A的含量也可能会发生变化，检测1mg/kg体重的剂量组的S77F这个患者，可以检测到视黄醇蛋白和维生素A和甲状腺转运蛋白一样发生降低。
D：在1mg/kg体重的剂量组的V30M4个患者，可以观察到突变型甲状腺转运蛋白和非突变型甲状腺转运蛋白之间存在很强的相关性，两种蛋白降低的水平相似。

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ALN-TTR02组结果：
A:和安慰剂相比较，0.01-0.05mg/KG体重的剂量组两个组和安慰剂组比较，对TTR的基因抑制作用无显著性变化。
0.15，0.3，0.5mg/kg体重的3个剂量组则有明显的快速，有限和持续性基因抑制作用。对照组siRNA是针对PCSK9基因的siRNA，和ALN-TTR02递送系统一致。