A型肉毒毒素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制

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A型肉毒毒素胶体金免疫层析法检测试纸条的研制

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胶体金免疫层析法 (immuno-chromatographic assay，ICA)试纸技术可用于检测食物、患者呕吐物或粪便以及血清和土壤中的肉毒毒素。
方法 ：采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记 A型肉毒毒素的多抗体，制成免疫层析检测试纸条。
结果 ：肉毒毒素 ICA试纸条可以特异性检测 A、B和 E型肉毒毒素。
检测中国兰州生物制品研究所注射用A型肉毒毒素标准品 ，灵敏度可达 2U／ml。与金黄色葡萄球菌肠毒素等抗原无交叉反应 。

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精制注射用A型肉毒毒素由兰州生物制品研究所生产 ，110U／支 (1U=1LD50，10U约为1ng)。

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柠檬酸盐还原法制备胶体金
① HAucL4 配制成 0.01％水溶液 ，取 100ml加热至沸 ，
② 搅动状态下加入1.5ml的l％柠檬酸三钠水溶液。
③ 液体颜色为葡萄酒红色，液体为25nm大小的胶体金颗粒。

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最低偶联抗体浓度的测定
调胶体金溶液至ph=9，待标记的抗体稀释到不同的浓度，分别加1ml胶体金溶液。
混匀后室温下放置5min。
加入0.1ml的10%NaC1水溶液混匀。
静置10-20min观察液体颜色。
胶体金颜色不变时所加的最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最低浓度。
以此为基础增加20%抗体量，即为胶体金偶联抗体适合浓度。
偶联抗体的金颗粒，即为免疫金探针。

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透射电镜下观察胶体金：
椭圆或者圆形，大小均一，直径约为25nm。
偶联抗体后，可见金颗粒外周有明显的低电子密度晕圈，表面吸附蛋白。

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制备检测试纸条:
PB缓冲液稀释抗体，点样仪 ，包被硝酸纤维素膜，晾干备用。制备好的胶体金探针溶液浸润玻璃纤维膜，-20℃放置30min，-50℃冷冻抽干。
将包被好的硝酸纤维素膜，浸有免疫金探针的玻璃纤维膜，样品垫，吸水滤纸，背板组装后，形成ICA检测试纸。

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肉毒毒素的检测（敏感性检测）：
以兰州生物制品研究所生产的精制注射用A型肉毒毒素为标准品，进行有限稀释，作为检测样品。
可检出20U/ml，即20LD50(约2ng/ml），对比文献中报道，ELISA方法检测的敏感性是100DLM。
同时，用粗制的B型和E型了肉毒毒素，以及A型和B型金黄色葡萄球菌肠毒素做为对照。
能检测出低于10ug/ml的B型和E型肉毒毒素。
不与A型肠毒素和B型肠毒素交叉反应。

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模拟标本中的肉毒检测：
选用几个常见的肉毒中毒食品，如火腿肠，腐乳，豆豉，蘑菇，牛奶，以及人血清，普通肉汤培养基，和土壤用于制备模拟标本。
固体食品各取2g，剪碎置于容器，加入5ml生理盐水，充分混匀，静置沉淀。
土壤取1g，加入5ml生理盐水，2000rpm离心10min。
液体食品用生理盐水1：4稀释。
样品处理后加入不同浓度的A型肉毒毒素，作为模拟阳性标本。

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